Cтраница 2
После того как внесенная в пробирки смесь агара и антисыворотки затвердеет, сверху наносят 0 3 % - ный расплавленный агар на высоту 8 - 10 мм. Как только затвердеет и этот слой, на него наслаивают смесь расплавленного агара с раствором антигена на высоту 20 мм. [16]
Для обнаружения растворяющей способности таких бактерий М. Ф. Федоров ( 1957) рек9мендует на дно чашки Петри насыпать 0 1 - 0 2 г Са3 ( РО4) 2 и налить в нее расплавленный агар с 2 % глюкозы в почвенном экстракте, при осторожном перемешивании фосфат равномерно распределить по чашке. Если такой агар засеять бактериями, образующими кислоту, то при их развитии получатся колонии, окруженные прозрачным ореолом за счет растворения фосфата. [17]
После гель-фильтрации на пластинках 10 - 20 см гель сефадекса удаляют механическим путем, оставляя только полоску шириной 3 - 5 см, содержащую разделяемые белки. Затем пластинку заливают расплавленным агаром ( охлажденным до 50 С), который при застывании образует гель толщиной 1 мм. При аккуратном выполнении этой операции агар покрывает полоску сефадекса, не нарушая слоя. Таким путем удается получить хорошие зоны преципитации, однако следует заметить, что эта методика требует большого экспериментального навыка. Полоски помещают на агаровый гель, где осуществляют Иммунодиффузию. [18]
В чашку Петри, покрытую изнутри пленкой агара, помещают три металлических кубика с гранью 10 мм, расставив их на расстоянии 1 см один от другого, как показано на фиг. Затем в чашку наливают расплавленный агар, образующий слой толщиной 3 - 6 мм, и помещают ее в холодильник. После затвердения агара и удаления металлических кубиков в слое агарового геля остаются лунки, точно соответствующие форме и размерам кубиков. [19]
Затем примерно в 5 мм от линии разреза в геле делают лунку для внесения образца, в которую наливают исследуемый материал, и обычным способом подвергают его электрофорезу. По окончании электрофореза смешивают расплавленный агар со специфической иммунной сывороткой и заливают им свободную половину стекла. Образование преципитатов происходит частично в оставшейся половине агарового геля и частично в геле, нанесенном на стекло после электрофореза. При обычной постановке иммуноэлектрофореза низкомолекулярные белки ( например, белки Бенс-Джонса) благодаря быстрой диффузии могут мигрировать на значительное расстояние от лунки и, если они попадут в канавку для иммунной сыворотки, полосы преципитации не образуется. Метод Бакхауза позволяет избежать затруднений такого рода, так как в этом случае канавка для иммунной сыворотки просто отсутствует, а полосы преципитации низкомолекулярных белков появляются в слое агарового геля, нанесенном после электрофореза. [20]
Количество воды, предназначенное для посева, вносится в чашку Петри, причем, если должно быть внесено все содержимое пипетки, то после опорожнения ее, наружная капля снимается с конца ее прикосновением ко дну чашки. Вливаемый вслед затем в чашку расплавленный агар не должен иметь температуру выше 42 - 44 С. Питательная среда наливается в количестве 7 - 10 мл, в зависимости от величины чашки. Края пробирки, перед тем как ввести ее под приподнятую крышку чашки Петри, фламбируются. [21]
Рекомендуется растворять агар-агар в аппарате для стерилизации текучим паром или в автоклаве, не закрывая крана для выпуска пара. Установив рН 7 2 - 7 4, расплавленный агар в горячем виде фильтруют через ватнр-марлевый фильтр, предварительно смоченный теплой водой. Фильтрат доводят до исходного объема водой, если он прозрачный, разливают во флаконы или пробирки, стерилизуют, как указано выше. [22]
Этот слой должен иметь толщину 3 - 4 мм и покрывать всю поверхность стекла и полоски фильтровальной бумаги. Для этого требуется примерно 250 - 300 мл расплавленного агара. [23]
Суспензию вносят в стерильную чашку Петри, заливают расплавленным агаром ( охлажденным до 45 С) и перемешивают с ним. При глубинном посеве показатели получаются более низкие. [24]
После того как внесенная в пробирки смесь агара и антисыворотки затвердеет, сверху наносят 0 3 % - ный расплавленный агар на высоту 8 - 10 мм. Как только затвердеет и этот слой, на него наслаивают смесь расплавленного агара с раствором антигена на высоту 20 мм. [25]
По окончании электрофореза рядом с полоской геля, содержащего разделенные антигены, наливают расплавленный агар, смешанный с раствором контрольных ( абсорбирующих) антигенов, таким образом, чтобы получилась вторая полоска шириной 5 мм. [26]
Перед использованием отмытого агара в нем определяют содержание сухого вещества. Для этого, тщательно взвесив чашку Петри, в нее наливают 10 мл расплавленного агара. После охлаждения чашку Петри вновь взвешивают и вычисляют концентрацию агара в отмытом геле. Зная эту величину, отмытый агар расплавляют и 0 9 % - ным раствором Nad доводят до нужной концентрации, прибавив в качестве консерванта 0 01 % мертиолата. [27]
Обычно иммуноэлектрофорез проводят в слое агарового геля на стеклянных пластинках размером 180 х 130 мм, которые следует перед опытом тщательно вымыть, обезжирить, высушить и расположить строго горизонтально; любое отклонение пластинки от горизонтального уровня приводит к неравномерности толщины агарового геля. Рекомендуется применять следующий прием: стеклянную кювету соответствующего размера заполняют 5 % - ным расплавленным агаром; после его затвердения образуется горизонтальная поверхность, на которую и помещают стеклянную пластинку. Для того чтобы положение пластинки всегда было строго горизонтальным, после затвердения агара кювету не следует сдвигать с места. [28]
Чтобы покрыть внутреннюю поверхность пробирок тонким слоем агара, их заполняют 0 1 % - ным расплавленным агаром с помощью капиллярной пипетки и сразу же после заполнения агар сливают. Агаровые пленки высушивают, поместив пробирки в эксикатор. [29]
Сначала исследуемый антиген подвергают электрофорезу макрометодом, описанным на стр. Затем в непосредственной близости от области разделения антигена в агаровом геле вырезают широкий желобок, который заполняют смесью расплавленного агара с иммунной сывороткой. Белки, разделенные в электрическом поле, диффундируют в агаровый гель, содержащий антитела. Расстояние, проходимое белками обусловлено закономерностями линейной диффузии в геле ( см. стр. [30]