Проведение - электрофорез
Cтраница 3
В детской глазной консультативной поликлинике в течение 2 5 лет работает физиотерапевтический кабинет. Кабинет оснащен современной аппаратурой, в частности имеется гальваническая доска АГН-2, ГВП-3 для проведения электрофореза, аппарат УВЧ-4 для ультравысокочастотной терапии, аппараты УТП-1, УТП-3 для проведения ультразвуковой терапии, аппарат ОКУФ для ультрафиолетового лечения. Назначение физиотерапевтических процедур и контроль за эффективностью лечения осуществляет врач-окулист, прошедший соответствующую подготовку. [31]
Метод пептидных карт на одном листе бумаги сейчас следует рассматривать скорее как аналитический, чем как препаративный. При препаративном разделении пептидов в тех же условиях обычно смесь пептидов последовательно разделяется методами электрофореза и хроматографии в несколько приемов, каждый раз нанося пробу во всю ширину бумаги. После проведения электрофореза вырезают полосы бумаги таким образом, чтобы в середине и по трем краям оставались узкие полоски бумаги. После проявления этих полосок нингидрином вырезанные полосы вставляются обратно, и на них карандашом отмечаются пептидные зоны. Подобные трудоемкие операции связаны с необходимостью иметь достаточное количество вещества для дальнейшего анализа. [32]
Для выявления локализации белковых полос, обладающих еллюлазной активностью, после изоэлектрофокусирования или электрофореза используют Brlnd-целлобиозид с последующим экислением продукта мононитротетразолиевым синим. Для этого 2 мг Brlnd-целлобиозида и 10 мг мононитротетразолиевого синего растворяют в 0 3 мл диметилформамида, добавляют 10 мл 0 1 М ацетатного буфера, рН 5 0, получая таким образом среду для инкубирования. Пластины геля после проведения электрофореза или изоэлектрофокусирования промывают тем же буфером и заливают проявляющим раствором. Окраска полос стабильна в течение нескольких недель. [33]
Для выявления локализации белковых полос, обладающих целлюлазной активностью, после изоэлектрофокусирования или электрофореза используют Brlnd-целлобиозид с последующим окислением продукта мононитротетразолиевым синим. Для этого 2 мг Brlnd-целлобиозида и 10 мг мононитротетразолиевого синего растворяют в 0 3 мл диметилформамида, добавляют 10 мл 0 1 М ацетатного буфера, рН 5 0, получая таким образом среду для инкубирования. Пластины геля после проведения электрофореза или изоэлектрофокусирования промывают тем же буфером и заливают проявляющим раствором. Окраска полос стабильна в течение нескольких недель. [34]
Изложенный метод с точки зрения канонов классической аналитической химии противоестествен. Для установления структуры гомогенного полинуклеотида его превращают в чрезвычайно сложную смесь фрагментов. Но именно это дает возможность после проведения электрофореза с одного геля сразу прочесть структуру, состоящую из многих десятков, а в некоторых случаях даже из нескольких сотен звеньев. Это связано со спецификой объекта - биополимера, построенного из большого числа заранее изученных и не слишком разнообразных структурных элементов. [35]
Электрофоретическому разделению веществ мешает их диффузия. В некоторых случаях гели выполняют роль сит. Например, в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата атрия разделение предварительно дентурированных белков происходит в соответствии с размерами их молекул. При проведении электрофореза в градиентном геле разделяемые вещества мигрируют в направлении уменьшения диаметра пор геля, и поэтому с увеличением расстояния от старта задерживаются все более мелкие молекулы. [36]
Необходимым условием разделения белков является их растворимость в используемом буферном растворе. Этим обстоятельством часто пренебрегают, и во многих случаях в результате анализируется только растворимая часть образца. Поскольку растворимость многих белков зависит от рН и ионной силы, ее характеристика особенно важна, если белковую смесь хромато-графируют в градиенте рН или ионной силы. Особенно наглядно влияние растворимости прослеживается при проведении электрофореза в полиакриламидном геле: агрегированный материал не может войти в гель и остается на старте. [37]
Реакционную смесь инкубируют 4 ч при 4О С. Смесь охлаждают несколько часов и центрифугируют при 17 ООО g в течение ЗО мин для осаждения комплекса бентонит-нуклеаза. Надосадочную жидкость отделяют микропипеткой, смешивают с двумя объемами концентрированного МНдОН, выдерживают при комнатной температуре в течение 2 ч и затем лиофилизуют. Остаток растворяют в 5 - 20 мкл воды для проведения двумерного электрофореза. [38]
Один из критериев чистоты белка состоит в том, что при электрофорезе чистый белок дает только одну полосу. Если белок, считавшийся ранее чистым препаратом, при электрофорезе дает две полосы, то это означает, что он не гомогенен. При этом не исключено, конечно, что он представляет собой смесь субъединиц с различной степенью полимеризации, однако такие случаи являются скорее исключением, чем правилом. Смесь, которая не разделяется при некоторых заданных условиях электро-форетического эксперимента, можно разделить в других условиях, например если изменить значение рН при проведении электрофореза или использовать метод седиментации в поле центробежных сил. Для того чтобы с уверенностью считать белок чистым, необходимо его проверить не по одному, а по нескольким критериям гомогенности. [39]
Определяют расстояние, пройденное каждым белком от стартовой линии. Определение можно проводить визуально или с помощью денситометра при 550 - 600 нм. Строят калибровочный график, откладывая по оси абсцисс длину пути 1а, пройденного данным белком, а по оси ординат - логарифм его молекулярной массы. Определив длину пути, пройденного белком с неизвестной молекулярной массой 1Х, пользуясь калибровочным графиком, определяют молекулярную массу исследуемого белка. При проведении электрофореза в трубочках часто трудно получить хорошо воспроизводимые результаты на разных трубках. В этом случае определяют не абсолютную, а относительную подвижность белков. Для этого определяют отношение длины пробега белковой зоны либо к общей длине геля, либо к длине пробега лидирующего красителя. После этого строят зависимость относительной подвижности белков от логарифма их молекулярной массы. [40]
После нанесения сыворотки прорез В крышке закрывают вкладышем, поднимают ручку 13 и поворачивают имеющийся на ней выступ так, чтобы он держался над крышкой камеры. Включают выпрямитель в сеть, затем тумблером 2 включают ток. При этом загорается лампочка на корпусе выпрямителя. Если лампочка не загорелась, следует проверить, поднята ли ручка 13 на камере и в случае необходимости поднять ее и закрепить выступом на краю крышки. Однако необходимая для проведения электрофореза сила тока зависит от качества бумаги, поэтому величину силы тока или напряжения следует уточнить у преподавателя. [41]
 |
Установка для проведения электрофореза на бумаге. [42] |
При обработке парами J2 зоны щелочных металлов проявляются в виде коричневых пятен. Как уже было отмечено, зона лития продвигается меньше всего по направлению к катоду, затем следует зона натрия; калий, рубидий и цезий образуют следующую одну зону. В качестве примера укажем, что при проведении электрофореза по способу [853] зона лития передвигается на расстояние 16 - 19 см, натрия 22 - 24 5 см, калия, рубидия и цезия 30 6 - 34 7 см от места нанесения анализируемого раствора. Степень передвижения зон различается на 4 - 10 % в зависимости от направления, по которому вырезана полоска для электрофореза из листа бумаги. [43]
Доминирующее влияние на электромиграцию оказывает форма соединения, в которой наносится элемент на носитель. Это особенно отчетливо проявляется в случае платиновых металлов, поведение и успех разделения которых зависят от предыстории раствора, его предварительной обработки. Наглядной иллюстрацией могут служить исследования электромиграции платиновых металлов с электролитами ЭДТА [1,2,18,45] и НТА [1, 2], проведенные разными авторами. Результаты таких исследований иногда трудно сравнимы. Так, Мак Невин и Дантон [18] перед проведением электрофореза упаривают растворы хлоридов платиновых металлов, обрабатывают остаток 1 М НС1, переводят Rh ( III) в желтую ка-тионную форму путем соответствующего подщелачивания раствора разбавленным раствором NaOH, чтобы вновь растворить образующийся осадок. Устанавливают рН 2 - 3 разбавленной НС1 и добавляют 2 - 3 моля твердой ЭДТА на каждый моль металла. Доводят рН до 9 разбавленным раствором NaOH и разбавляют соответствующим образом водой. [44]
Изоэлектрическое фокусирование в геле имеет определенные преимущества по сравнению с ИФ в среде со стабилизованным градиентом плотности. Эти преимущества состоят в следующем: 1) сокращается длительность разделения; 2) полностью подавляется термическая конвекция; 3) применяется простое оборудование для ИФ; 4) возможно одновременное разделение нескольких образцов; 5) возможно обнаружение с помощью различных красителей и различных методик; 6) возможно объединение ИФ и зонного электрофореза в двухмерном варианте; 7) достаточно небольшого количества образца; 8) возможно обнаружение белков методом иммунодиффузии. Однако при применении геля возникают проблемы, связанные с молекулярно-ситовым эффектом, который имеет место в основном при разделении больших молекул. В настоящее время этот метод ( сокращенное обозначение ИФПАА или ПАГИФ) является общепринятым и широко используется. В отдельных случаях, согласно данным [73], при проведении дискретного трубчатого электрофореза в полиакриламидном геле допускается окрашивание. Типичный градиент напряжения для 8-часового разделения составляет 200 В на 60 мм. Если тепло отводится, то напряжение можно увеличить и соответственно сократить длительность разделения. [45]
Страницы: 1 2 3