Клонирующий вектор

Cтраница 1

Клонирующий вектор ( Cloning vector) Молекула ДНК ( плазмидная или вирусная ДНК), предназначенная для клонирования ДНК-мишени. [1]

Поскольку клонирующие векторы не содержат генов vir, они сами не способны обеспечивать транспорт и интеграцию Т - ДНК в клетки растения-хозяина. Чтобы решить эту проблему, было разработано два подхода. [2]

Протеолитическое расщепление химерного белка фактором свертывания крови Ха. Фактор Ха узнает аминокислотную последовательность, разделяющую два компонента химерного белка. После расщепления высвобождается функциональный белок, кодируемый клонированным геном.| Клонирующий вектор системы слияния. Он содержит ген устойчивости к ампициллину ( Атрг в качестве селективного маркера, 5 -концевой сегмент гена ompF, кодирующий N-конец наружного мембранного белка, сайт для рестрицирующей эндонукле-азы Abel и укороченный ген Р - галактозидазы ( lacZ. Ген, который хотят клонировать, встраивают в Abel-cam. После транскрипции и трансляции этой генетической конструкции образуется трехкомпонентный химерный белок. [3]

Один из клонирующих векторов системы слияния, сконструированных для получения специфических антител, содержит 5 -концевой сегмент гена ompF E. Этот сегмент содержит информацию, необходимую для инициации транскрипции и трансляции химерного гена, а также для секреции химерного белка. Несмотря на то что укороченный ген lacZ лишен кодонов для первых восьми аминокислот, кодируемый им белок сохраняет ферментативную активность. [4]

Двухцистронный вектор ( Dicistronic vector) Клонирующий вектор, предназначенный для экспрессии двух генов в одной клетке млекопитающих. Гены находятся под контролем одного промотора и сигнала полиаде-нилирования. [5]

Вставка ( Insert) Сегмент ДНК, встроенный в клонирующий вектор. [6]

Исключение ( Excision) Вырезание сегмента ДНК из хромосомы или клонирующего вектора, осуществляемое in vivo или in vitro с помощью специфического фермента. [7]

Субклонирование ( Subcloning) Перенос части уже клонированной молекулы ДНК в другой клонирующий вектор. [8]

ДНК нужны векторы меньшего размера, поэтому участки ДНК, несущественные для клонирующего вектора, должны быть удалены. [9]

В этой системе на неонкогенной Ti-плазмиде синтезируются продукты vir - генов, которые мобилизуют участок Т - ДНК бинарного клонирующего вектора. Продуцируя белки, кодируемые v / r - генами, неонкогенная Ti-плазмида выступает в роли помощника, способствуя встраиванию Т - ДНК из бинарного клонирующего вектора в хромосомную ДНК растения. [10]

Сборка синтетического гена из коротких олигонуклеотидов. Синтезируют отдельные олигонуклеоти-ды длиной от 20 до 60 звеньев каждый с такими нуклеотидными последовательностями, чтобы при отжиге из них образовалась двухцепочечная молекула. Оставшиеся одноцепочечные разрывы сшивают с помощью ДНК-лигазы Т4. [11]

Синтетические гены могут быть сконструированы так, чтобы помимо белок-кодирую-щих последовательностей они содержали концевые участки, обеспечивающие их встраивание в клонирующий вектор ( сайты для рестри-цирующих эндонуклеаз), а также, если это необходимо, сигнальные последовательности для правильной инициации и терминации транскрипции и трансляции. [12]

А. Дидезоксинуклеотид ( отсутствуют 2 - и 3 -гидроксильные группы в кольце. Б. Дезоксинук-леотид ( отсутствует только 2 -гидроксильная группа.| Синтез ДНК в обычных условиях. Очередной дезоксирибонуклеотид ( дезоксирибонуклеозид-трифосфат. dNTP спаривается с комплементарным нуклеотидом матричной цепи. Между З - гидроксиль-ной группой последнего нуклеотида в растущей цепи и а-фосфатной группой присоединяемого нуклеотида образуется фосфодиэфирная связь. [13]

Первый шаг стандартной процедуры диде-зокси-секвенирования состоит в гибридизации синтетического олигонуклеотида длиной 17 - 20 звеньев со специфическим участком одной из цепей клонирующего вектора, соседствующим со вставкой. Этот олигонуклеотид является праймером, поставляющим З - гидроксильную группу для инициации синтеза. Концентрацию каждого дидезоксинуклеотида подбирают таким образом, чтобы он оказался включенным по всем позициям в смеси растущих цепей, а не только в первой встретившейся ему позиции. [14]

Клонирующий вектор несет участок Т - ДНК, содержащий клонированный ген. После введения в клетку Agrobacterium он подвергается гомологичной рекомбинации с резидентной разоруженной ( неонко-генной) Ti-плазмидой с образованием одной плазмиды, несущей генетическую информацию, необходимую для переноса генетически измененной области Т - ДНК в растительную клетку. [15]

Страницы: 1 2