Cтраница 2
Для определения АТФазной активности к 1 мл среды инкубации добавляется 0 1 мл раствора миозина в 0 5 М КС1, содержащего около-10 мг белка в 1 мл. [16]
ПХМБ, а затем реакцию начинают, добавляя в каждую пробирку по 1 4 мл раствора миозина. Одновременно следует удостовериться, что при взаимодействии с АТФ АТФазная активность миозина даже в присутствии ПХМБ стабильна и не меняется за все время проведения АТФазной реакции. Для этого в отдельном эксперименте определяют зависимость нарастания неорганического фосфата от времени в присутствии количеств ПХМБ, достаточных для 50 - 70 % - ной модификации белка. [17]
В одну пробирку наливают 5 капель раствора яичного белка, во вторую - раствора желатина, в третью - раствора миозина. Вовсе пробирки добавляют по 3 - 5 капель концентрированной азотной кислоты и нагревают. В первой и третьей пробирках образуется белый осадок, который при нагревании окрашивается в желтый цвет и постепенно растворяется ( происходит гидролиз белка), сообщая желтую окраску раствору. Пробирки охлаждают, к охлажденным растворам прибавляют ( осторожно) по 10 капель концентрированного раствора аммиака или 30 % - ного раствора гидроксида натрия и наблюдают изменение окраски растворов вследствие образования аммонийной соли динитротирозина. [18]
В одну пробирку наливают 5 капель раствора яичного белка, в другую - - раствора желатина, в третью - раствора миозина. [19]
В четыре пробирки наливают по 5 капель: в первую - раствора яичного белка, во вторую - раствора желатина, в третью - раствора миозина, в четвертую - раствора тирозина. Во все четыре пробирки добавляют по 2 - 3 капли реактива Миллона и осторожно нагревают. [20]
В одну пробирку наливают 5 капель 1 % - ного раствора яичного белка, во вторую - 1 % - ного раствора желатина, в третью - раствора миозина. В каждую пробирку добавляют по 5 капель 30 % ного раствора гидроксида натрия и по 1 капле 5 % - ного раствора ацетата свинца. При интенсивном кипячении жидкость в пробирках с яичным белком и миозином темнеет, так как образуется черный осадок сульфида свинца, В пробирке с желатином черного осадка не образуется, так как желатин не содержит серусодержащих аминокислот. [21]
При разбавлении раствора до 0ЗМ по КС1 выпадает осадок актомиозина и в растворе остается почти чистый миозин. В отличие от актомиозина, растворы миозина значительно менее вязкие. [22]
Сравнивается АТФазная активность миозина в двух рядах проб. В первом ряду порядок смешивания растворов следующий: сначала к раствору миозина добавляется раствор ПХМБ, а после взаимодействия белка с модификатором, продолжающегося в течение 5 мин, добавляется инкубационная среда, содержащая АТФ. [23]
Инкубационную смесь составляют, смешивая компоненты в следующем соотношении: на 1 мл раствора буфера 0 2 мл СаС12, 0 3 мл раствора АТФ, 0 3 мл воды. Только после этого начинают реакцию, добавляя в пробу 0 2 мл раствора миозина, содержащего 2 - 3 мг белка. Смесь хорошо перемешивают и инкубируют при 26 С в течение 3 - 5 мин. Реакцию останавливают добавлением 1 мл 7 5 % - ного раствора ССЦСООН. Раствор тотчас же фильтруют и в фильтрате определяют неорганический фосфат, образовавшийся в процессе ферментативного расщепления АТФ. Для определения предобразованного фосфата параллельно ставят контрольную пробу, в которую СОзСООН приливают к инкубационной смеси перед добавлением миозина. [24]
Такие белки, как основной белок миофибрилл мышц - миозин и белок крови - фибриноген, занимают промежуточное положение. Эти белки растворимы в солевых растворах, но их молекулы имеют палочковидную структуру. Растворы миозина и фибриногена обладают, подобно растворам фибриллярных белков, большой вязкостью. [25]
Подготовка миозина и папаина. Папаиновый субфрагмент-1 миозина получают, используя в качестве протеазы папаин. Перед проведением протеолиза необходима специальная подготовка раствора миозина, которая заключается в диализе его ( 20 мг / мл в 0 5 М Ktl) в течение ночи против 30-кратного объема 0 2 М ацетата аммония ( рН 7 0), содержащего 2 мМ ЭДТА. [26]
Наиболее общее положение состоит в неразрывной связи механохимии с ферментативной активностью рабочих веществ механохимическои системы - сократительных и регуляторных белков. Отсюда следует, что принудительное конформационное изменение белка, вызванное механическим воздействием, должно изменять его ферментативную активность. Это положение, высказанное в работе [151] ( см. также [152]), было подтверждено прямыми опытами. Воробьев и Кухарева помещали раствор миозина в динамооптиметр. В работах [154-156] показано сильное влияние ультразвука на активность ферментов, исследовано регулирование механическим воздействием скоростей ферментативных реакций в полиакриламидном геле, а также регулирование ферментативных свойств химотрипсина посредством растяжения капроновой нити, к которой этот белок был ковалентно присоединен. [27]