Cтраница 2
Полученный экстракт центрифугируют при 3000 об / мин в течение 20 мин. При содержании в печени большого количества гликогена су-пернатант представляет собой жидкость молочного цвета. Ее сливают в стакан, а осадок снова растирают с равным объемом 3 % - ного раствора трихлоруксусной кислоты, центрифугируют и второй супернатант объединяют с первым. Если гликогена в печени мало и первый экстракт представляет только опалесцирующий раствор, то второй экстракции не проводят. К раствору гликогена приливают равный объем 96 % - ного этанола и тщательно перемешивают Осадок гликогена собирают центрифугированием при 3000 об / мин в течение 30 мин, а затем гомогенизируют в 2 - 3 объемах, бидистиллированной воды. Приливают равный объем этанола, перемешивают и снова центрифугируют. Эту операцию повторяют 3 - 4 раза, после чего осадок гликогена промывают два раза 96 % - ным этанолом и высушивают в ваку-умэксикаторе над свежепрокаленным хлористым кальцием. [16]
Гликоген состоит из остатков молекул глюкозы. Число остатков глюкозы в гликогене значительно больше, чем в крахмале. Образуется гликоген из глюкозы в печени животного организма. Это белый аморфный порошок, растворимый в воде и легко набухающий. Гликоген способен соединяться с белками, с иодом растворы гликогена окрашиваются в винно-красный цвет. Окраска исчезает при кипячении и появляется вновь при охлаждении. В организме гликоген расщепляется под действием ферментов до глюкозы и молочной кислоты. Он имеет большое значение в энергетическом балансе организма и служит запасным веществом в животных организмах. [17]
Замороженную ткань ( - 30 г) помещают в механический гомогенизатор с 300 мл диметилсульфоксида и перемешивают - 2 мин. Смесь центрифугируют в течение 20 мин при 1800 об / мин, надосадочный раствор фильтруют через фильтровальную бумагу ватман № 54 с отсасыванием и быстро выливают в 3 л метанола, содержащего 5 г хлористого натрия. Остаток после центрифугирования снова экстрагируют 300 мл диметилсульфоксида тем же способом и профильтрованный надосадочный раствор прибавляют к тому же метанольному раствору. Светло-коричневый осадок сырого гликогена отделяют декантацией и центрифугированием и растворяют в 80 - 100 мл диметилсульфоксида. Раствор центрифугируют при помощи настольной центрифуги ( 6500 об / мин) и гликоген осаждают из надосадоч-ного раствора 3 объемами спирта. Процедуру повторяют дважды с уменьшающимися количествами диметилсульфоксида, пока раствор гликогена не станет почти бесцветным и лишь слегка опалесцирующим. Затем продолжают очистку тем же способом, применяя вместо диметилсульфоксида воду, чтобы растворить осадок частично очищенного гликогена. Водный слой отделяют и центрифугируют при - 6500 об / мин в течение 1 час. Процедуру повторяют несколько раз, последний надосадочный раствор диализуют против холодной дистиллированной воды и лиофилизуют. [18]
Для прямого определения выхода флуоресценции необходимо сравнить скорость поглощения возбуждающего света с полной скоростью испускания флуоресценции при всех длинах волн и во всех направлениях. В принципе это просто, но на практике это сделать довольно трудно. Он основан на сравнении интенсивности флуоресценции, испускаемой с передней поверхности образца, с интенсивностью возбуждающего света, рассеиваемого полностью рассеивающей матовой поверхностью. Метод, предложенный Вебером и Хилом [142], является в некотором отношении абсолютным методом, поскольку в нем не требуется сравнения со стандартным флуоресцирующим раствором. Он также имеет то преимущество, что применим к разбавленным растворам, в которых эффекты поглощения малы. В этом методе интенсивность флуоресценции сравнивается с интенсивностью возбуждающего света, рассеиваемого разбавленным раствором гликогена. Доля возбуждающего света, рассеиваемого раствором гликогена, определяется по оптической плотности последнего. В основе метода лежит дипольное рассеяние раствором гликогена, и иногда на практике наблюдается разброс в пределах 5 % в рассеивающей способности растворов одинаковой оптической плотности. [19]
Для прямого определения выхода флуоресценции необходимо сравнить скорость поглощения возбуждающего света с полной скоростью испускания флуоресценции при всех длинах волн и во всех направлениях. В принципе это просто, но на практике это сделать довольно трудно. Он основан на сравнении интенсивности флуоресценции, испускаемой с передней поверхности образца, с интенсивностью возбуждающего света, рассеиваемого полностью рассеивающей матовой поверхностью. Метод, предложенный Вебером и Хилом [142], является в некотором отношении абсолютным методом, поскольку в нем не требуется сравнения со стандартным флуоресцирующим раствором. Он также имеет то преимущество, что применим к разбавленным растворам, в которых эффекты поглощения малы. В этом методе интенсивность флуоресценции сравнивается с интенсивностью возбуждающего света, рассеиваемого разбавленным раствором гликогена. Доля возбуждающего света, рассеиваемого раствором гликогена, определяется по оптической плотности последнего. В основе метода лежит дипольное рассеяние раствором гликогена, и иногда на практике наблюдается разброс в пределах 5 % в рассеивающей способности растворов одинаковой оптической плотности. [20]