Cтраница 2
В результате образуется смесь, состоящая из 2 - и З - рибонуклеотидов общим числом ( га - 2), которые соответствуют внутренней части полинуклеотидной цепи, из одного 2 - или З - фосфата головного нуклеотида ( или нуклеозида) и из одного нуклеотида ( или нуклеозида) со свободной З - ОН-группой на хвосте. Расщепление фосфодиэфирных связей во внутренней части полинуклеотидной цепи происходит более или менее беспорядочно и идет по Ь - положениям. [16]
Фосфолипазу D выделяют из растительных объектов. Функцией этого фермента является расщепление фосфодиэфирной связи между фосфатидной кислотой и азотистым основанием в молекулах фосфолипидов-глицеридов. [17]
Характерной особенностью поведения РНК и олигорибонуклео-тидов в кислой среде является изомеризация природной 3 - - 5 -фос-фодиэфирной связи в 2 - - Б - фосфодиэфирную. Процесс идет конкурентно с расщеплением фосфодиэфирных связей. При неполном гидролизе РНК в образовавшихся олигонуклеотидах присутствует значительный процент ол и гомеров с изомерными связями. Продолжительный гидролиз в кислой среде, так же как и в щелочной, приводит к образованию мононуклеотидов. [18]
При переходе от нуклеозидов и нуклеотидов к олиго - и поли-нуклеотидам основные закономерности, связывающие лабильность N-гликозидных связей по отношению к кислотному гидролизу со строением нуклеозидных звеньев, сохраняются ( о влиянии фосфо-рилирования гидроксильных групп остатков Сахаров см. стр. Однако кислотный гидролиз N-гликозидных связей в полинуклеотидах сопровождается расщеплением фосфодиэфирных связей, причем в полирибонуклеотидах эти два процесса могут протекать независимо, а в полидезоксирибонуклеотидах расщепление фосфодиэфирных связей под действием кислот протекает после отщепления основания от соответствующего нуклеотидного звена ( подробнее - см. стр. [19]
При данном методе гидролиза эти условия являются оптимальными, так как они позволяют достичь достаточно полного расщепления фосфодиэфирных связей у дезоксирибозиль-ных звеньев, образовавшихся в результате апуринизации ДНК ( см. также стр. Большая продолжительность реакции приводит к частичной апиримидинизации ДНК и расщеплению соответствующих фосфодиэфирных связей, как было показано при изучении кинетики кислотного гидролиза пиримидиновых олигонуклеотидов. [20]
В молекуле полинуклеотида фосфомоноэфирные связи имеются только в концевых 3 - или 5 -звеньях. Химические реакции, которые позволили бы избирательно удалять концевые фосфатные группы в РНК без расщепления фосфодиэфирных связей, в настоящее время неизвестны, и для этих целей применяются ферментативные методы. Под действием ряда реагентов РНК могут расщепляться с образованием нуклеозидов. Во всех реакциях этого типа первой стадией является расщепление фосфодиэфирных связей с образованием моно - и олигонуклеотидов ( см. стр. [21]
Естественный путь для выяснения структурно-функциональных свойств тРНК состоит в ее ферментативном расщеплении на фрагменты и в исследовании их свойств. Баев и сотрудники [83] показали, что половины молекулы, полученные из дрожжевой Вал-TPHKi расщеплением фосфодиэфирной связи в пределах аятикодона и сами по себе неактивные, будучи смешаны, полностью восстанавливают акцепторную активность к аминокислоте. При самосборке 3 - и 5 -половины агрегируют в эквимолярном соотношении, и самосборка проходит количественно менее чем за 2 мин. Самосборка специфична - 3 - 5 -половины Вал - тРНК в присутствии 5 -половины других тРНК образуют только гомологичный комплекс. В каждой тРНК существует своя нуклео-тидная последовательность. Половины не обладают сродством к Вал - тРНК - синтетазе. [22]
Кислотный гидролиз ДНК приводит к более быстрому расщеплению связи между пуриновыми основаниями и дезоксирибозой, чем к расщеплению фосфодиэфирных связей. Кроме того, такие диэфиры устойчивы к щелочному гидролизу. Соучастие соседней с глико-зидной связью 2 -гидроксильной группы является существенной особенностью щелочного гидролиза РНК, см. гл. [23]
При переходе от нуклеозидов и нуклеотидов к олиго - и поли-нуклеотидам основные закономерности, связывающие лабильность N-гликозидных связей по отношению к кислотному гидролизу со строением нуклеозидных звеньев, сохраняются ( о влиянии фосфо-рилирования гидроксильных групп остатков Сахаров см. стр. Однако кислотный гидролиз N-гликозидных связей в полинуклеотидах сопровождается расщеплением фосфодиэфирных связей, причем в полирибонуклеотидах эти два процесса могут протекать независимо, а в полидезоксирибонуклеотидах расщепление фосфодиэфирных связей под действием кислот протекает после отщепления основания от соответствующего нуклеотидного звена ( подробнее - см. стр. [24]
Обнаружение альдитов периодатом и реактивом Шиффа позволяет отличить глицерин, окрашивающийся приблизительно через 5 мин после опрыскивания в темно-красный цвет, от ангидрорибита, который дает ярко-синее окрашивание только через 30 мин после опрыскивания. Реактив Шиффа также позволяет различать монофосфаты глицерина и рибита, поскольку 3-фосфат рибита окрашивается в характерный ярко-желтый цвет [34], в то время как остальные фосфаты окрашиваются в пурпурный и синий цвета. В глицеринтейхоевых кислотах, имеющих структуру типа 1, при расщеплении фосфодиэфирной связи в результате промежуточного образования циклофосфатов фосфатные группы могут оказаться на любом из соседних остатков глицерина. В итоге, как видно из приведенных в табл. 24.1 данных, образуется смесь фосфатов. Во всех исследованных таким образом глицеринтейхоевых кислотах типа 2 фосфатные группы этирифицируют первичные гидроксильные группы и глицерина и сахара, поэтому расщепление проходит преимущественно через промежуточное образование глице-рипциклофосфата и приводит к фосфату глицерина; в гидролизате присутствуют лишь незначительные количества фосфата сахара и незамещенного глицерина. [25]
Два типа полинуклеотидов - ДНК и РНК - резко различаются по стабильности фосфодиэфирных связей. В то время как РНК при относительно мягкой щелочной обработке гидролизуется до моно-нуклеотидов, ДНК в этих условиях довольно устойчива; то же относится к действию соединений тяжелых металлов ( см. стр. При кислотном гидролизе происходит деградация полимеров обоих типов, однако характер продуктов и механизм расщепления фосфодиэфирных связей для ДНК и РНК в этом случае различен. Большинство реакций, приводящих к расщеплению фосфодиэфирных связей в РНК, протекает по механизму трансфосфорилирова-ния с участием гидроксильной группы при С-2 остатка рибозы, в то время как для ДНК характерен распад фосфодиэфирных связей по механизму р-элиминации с предварительным отщеплением оснований ( см. стр. [26]
Два типа полинуклеотидов - ДНК и РНК - резко различаются по стабильности фосфодиэфирных связей. В то время как РНК при относительно мягкой щелочной обработке гидролизуется до моно-нуклеотидов, ДНК в этих условиях довольно устойчива; то же относится к действию соединений тяжелых металлов ( см. стр. При кислотном гидролизе происходит деградация полимеров обоих типов, однако характер продуктов и механизм расщепления фосфодиэфирных связей для ДНК и РНК в этом случае различен. Большинство реакций, приводящих к расщеплению фосфодиэфирных связей в РНК, протекает по механизму трансфосфорилирова-ния с участием гидроксильной группы при С-2 остатка рибозы, в то время как для ДНК характерен распад фосфодиэфирных связей по механизму р-элиминации с предварительным отщеплением оснований ( см. стр. [27]
В молекуле полинуклеотида фосфомоноэфирные связи имеются только в концевых 3 - или 5 -звеньях. Химические реакции, которые позволили бы избирательно удалять концевые фосфатные группы в РНК без расщепления фосфодиэфирных связей, в настоящее время неизвестны, и для этих целей применяются ферментативные методы. Под действием ряда реагентов РНК могут расщепляться с образованием нуклеозидов. Во всех реакциях этого типа первой стадией является расщепление фосфодиэфирных связей с образованием моно - и олигонуклеотидов ( см. стр. [28]
Дезаминированию под действием азотистой кислоты могут быть подвергнуты и остатки нуклеозидов в составе полинуклеотидов. Подобраны условия, в которых достигается полное дезаминирова-ние ДНК78 79; при этом, однако, в значительной степени происходит расщепление N-гликозидных связей пуриновых дезоксинуклео-тидных звеньев. Природа этой реакции не выяснена; возможно, что она состоит в алкилировании остатка нуклеозида ( сближенного пространственно с нуклеозидом, который претерпевает дезаминирование) под действием промежуточно образующегося диазосоединения ( ср. Полного дезаминирования РНК удается добиться при действии нитрита натрия в ледяной уксусной кислоте83; при этом происходит заметная деградация полимера за счет расщепления фосфодиэфирных связей. В более мягких условиях обработки, когда побочные реакции сводятся к минимуму, протекает лишь частично дезаминирование ДНК и РНК. [29]
Если олиго - или полинуклеотид фосфорилирован по З - концу, первой стадией является ферментативное дефосфорилирование. Затем следует периодатное окисление, превращающее З - концевой нуклеозидный остаток в 2 / 3 -диальдегид XVI, в котором 5 -фосфо-диэфирная связь находится в ( 3-положении к 3 -альдегидной группе ( подробнее о периодатном окислении см. стр. Завершающей стадией является расщепление 5 -фосфоэфирной связи в диальде-гидном производном XVI под действием различных первичных аминов. В результате образуется олиго - или полинуклеотид, укороченный с З - конца на одно нуклеотидное звено. Весь цикл превращений может быть повторен. От продукта превращения бывшего З - концевого нуклеотидного звена XVII при действии кислоты ( рН13) или щелочи ( рН 11) отщепляют основание, определяемое далее обычными аналитическими методами. Разрешающая способность метода ( возможность определять достаточно длинную З - концевую последовательность олигонуклеотида или РНК) зависит от полноты прохождения каждой стадии реакции. Важнейшей из этих стадий является расщепление фосфодиэфирной связи в диальдегиде XVI под действием аминов. [30]