Cтраница 4
Построение калибровочной кривой - калибровочную кривую для расчета протеолитической активности строят по тирозину. Этот эквивалент устанавливают для каждой партии реактива Фолина и каждого фотоэлектроколориметра. [46]
Ьора натра едкого ( 1 моль / л) и 0 1 мл 1 % раствора натрия дезоксихолата, затем прибавляют 4 мл реактива II, смесь перемешивают. После просветления раствора прибавляют 0 5 мл реактива Фолина, немедленно перемешивают и оставляют на 30 мин в темном месте при комнатной температуре. Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре при длине волны 750 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют смесь этих же реактивов без препарата. [47]
Две аликвотные порции раствора ( 0 4 - 1 2 мг цистина) вносят в градуированные цилиндры на 50 мл с притертыми пробками. После перемешивания вносят 2 мл фосфорно-18 - вольфрамовон кислоты ( реактив Фолина), предварительно разбавленной равным объемом воды, и тотчас же прибавляют к испытуемому раствору 1 мл свежеприготовленного 10Г раствора Na SOs, а к контрольному опыту - 1 мл воды. Растворы перемешивают и цилиндры помещают на 5 - 8 мин. Затем растворы доводят водой до 50 мл и производят отсчеты в фотоэлектрическом колориметре. Сравнивают с контрольным опытом. [48]
Способностью восстанавливать реактив Фолина в синее соединение обладает не только свободный тирозин, но и белок. Можно было бы ожидать, что интенсивность окраски, возникающей при взаимодействии реактива Фолина с белком, пропорциональна содержанию в белке тирозина и цис-теина. В действительности, оказалось, что если белок обработать предварительно солями меди, то даваемая им с реактивом Фолина окраска намного превышает ту, которую могли бы дать только названные аминокислоты. Считают, что в составе белковой молекулы, образовавшей медный комплекс, с реактивом Фолина взаимодействуют также и другие аминокислоты, а поэтому интенсивность возникающего окрашивания в известной мере пропорциональна содержанию белка. Лоури и сотрудники использовали этот принцип для количественного определения белка. [49]
Оба метода очень просты и быстры. Однако нельзя забывать, что интенсивность поглощения в ультрафиолете и синяя окраска с реактивом Фолина зависят от содержания тирозина и других ароматических аминокислот, которое варьирует от белка к белку. Необходимо поэтому стандартизировать анализируемую пробу белка по известному белку. [50]
Добавляют в каждую пробирку по 2 - 3 капли раствора едкого натра и по капле реактива Фолина. Отмечают появление синего окрашивания. [51]
В 2 чистые сухие пронумерованные мерные пробирки на 10 мл точно отмеривают пипеткой в первую - 1 мл стандартного раствора адреналина, во вторую - 1 мл исследуемого раствора. В каждую пробирку добавляют по 4 мл 10 % свежеприготовленного раствора углекислого нат-ркя и по 0 5 мл реактива Фолина. Жидкость постепенно окрашивается в синий цвет, достигающий наибольшей интенсивности через 3 - 5 минут. Содержимое про-бирок перемешивают и окраску исследуемой жидкости сравнивают в колориметре с окраской стандартного раствора адреналина. [52]
В контрольную кювету помещают 0 5 мл дистиллированной воды и 2 5 мл раствора ванилина. Полученные результаты пересчитывают по калибровочной кривой или по таблице. Для флороглюцина ванилиновый метод более чувствителен, чем метод с применением реактива Фолина. [53]