Cтраница 2
После отмывки преципитат растворяют в 1 5 мл биуретового реактива и доводят объем раствора до метки ( 2 5 мл) дистиллированной водой. После инкубации определяют оптическую плотность. [16]
Определение белка в препарате цитохромоксидазьь Содержание белка в полученном препарате измеряют с биуретовым реактивом ( с. Ионетани [3], которая состоит в том, что к раствору цитохромоксидазы перед добавлением биуретового реактива добавляют 0 05 мл 30 % - него раствора перекиси водорода. Такая обработка фермента позволяет уменьшить вклад поглощения фермента в оптическую плотность комплекса белка с биуретовым реактивом. [17]
В каждую пробирку наливают по 4 мл биуретового реактива. Содержимое пробирок хорошо перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 20 мин для развития окраски. В качестве контрольного раствора при измерении на ФЭКе используют биуретовый реактив. [18]
Биуретовый метод применяют в различных модификациях, различающихся условиями экстрагирования белка, способами внесения биуретового реактива и техникой колориметрирования. [19]
Определение белка в препарате цитохромоксидазьь Содержание белка в полученном препарате измеряют с биуретовым реактивом ( с. Ионетани [3], которая состоит в том, что к раствору цитохромоксидазы перед добавлением биуретового реактива добавляют 0 05 мл 30 % - него раствора перекиси водорода. Такая обработка фермента позволяет уменьшить вклад поглощения фермента в оптическую плотность комплекса белка с биуретовым реактивом. [20]
Прибавляют 0 2 мл сыворотки, смешивают и добавляют 1 мл эфира. Пробирку затыкают резиновой пробкой, сильно трясут ровно 30 секунд, а затем центрифугируют 10 минут при 3000 оборотах в минуту. Пипетку, заткнутую пальцем, осторожно проводят мимо выпавшей пластиночки глобулина и отбирают прозрачную жидкость в чистую пробирку. Отмеривают 1 5 мл этой жидкости в чистую пробирку и смешивают с 1 5 мл воды и 3 мл биуретового реактива. Дают постоять 30 минут и фотометрируют. В центрифужной пробирке смешивают 0 2 мл сыворотки с 4 8 мл 28 % - ного сульфита натрия и 1 мл эфира, затыкают резиновой пробкой и поворачивают пробирку на 180 10 раз. Затем центрифугируют 10 минут при 2000 оборотах в минуту, снимают, как выше, 3 0 мл прозрачной жидкости и смешивают в чистой пробирке с 3 0 мл биуретового реактива. Дают постоять 30 минут и фотометрируют при 540 гпц. [21]
Метод Кьельдаля относительно сложен, требует предварительного выделения белка из смеси, медленен, но при соблюдении всех предосторожностей - точен. Биуретовый метод - средней точности, быстр, может быть весьма полезным для сравнительных анализов. Безусловно, лучшим является широко используемый сейчас фотометрический метод Лоури. Интенсивность окраски, возникающей при одновременном протекании в нем биуретовой реакции и реакции Фолина, значительно большая, чем при применении одного лишь биуретового реактива. Установлено, что метод Лоури в 100 раз чувствительнее биуретовой реакции и в 10 - 20 раз - чем метод, основанный на измерении поглощения света при 280 ммк. [22]
Частицы, дефицитные по коэнзиму Q ( около 200 мг), суспендируют в стеклянном гомогенизаторе в небольшом объеме ( 1 - 2 мл) концентрированного пентанового экстракта ( см. выше), содержащего около 40 мкмоль коэнзима Q на 1 мг белка частиц. Осадок осторожно ополаскивают 1 мл охлажденного пентана. Полученный препарат реконструированных частиц высушивают в роторном испарителе до полного удаления пентана. В день опыта частицы трех типов ( лиофилизированные, экстрагированные пентаном и реконструированные) гомогенизируют в 0 25 М сахарозе ( концентрация белка 30 - 40 мг / мл), из каждого препарата отбирают по 0 05 мл суспензии для определения белка с биуретовым реактивом. [23]
Прибавляют 0 2 мл сыворотки, смешивают и добавляют 1 мл эфира. Пробирку затыкают резиновой пробкой, сильно трясут ровно 30 секунд, а затем центрифугируют 10 минут при 3000 оборотах в минуту. Пипетку, заткнутую пальцем, осторожно проводят мимо выпавшей пластиночки глобулина и отбирают прозрачную жидкость в чистую пробирку. Отмеривают 1 5 мл этой жидкости в чистую пробирку и смешивают с 1 5 мл воды и 3 мл биуретового реактива. Дают постоять 30 минут и фотометрируют. В центрифужной пробирке смешивают 0 2 мл сыворотки с 4 8 мл 28 % - ного сульфита натрия и 1 мл эфира, затыкают резиновой пробкой и поворачивают пробирку на 180 10 раз. Затем центрифугируют 10 минут при 2000 оборотах в минуту, снимают, как выше, 3 0 мл прозрачной жидкости и смешивают в чистой пробирке с 3 0 мл биуретового реактива. Дают постоять 30 минут и фотометрируют при 540 гпц. [24]
Прибавляют 0 2 мл сыворотки, смешивают и добавляют 1 мл эфира. Пробирку затыкают резиновой пробкой, сильно трясут ровно 30 секунд, а затем центрифугируют 10 минут при 3000 оборотах в минуту. Пипетку, заткнутую пальцем, осторожно проводят мимо выпавшей пластиночки глобулина и отбирают прозрачную жидкость в чистую пробирку. Отмеривают 1 5 мл этой жидкости в чистую пробирку и смешивают с 1 5 мл воды и 3 мл биуретового реактива. Дают постоять 30 минут и фотометрируют. В центрифужной пробирке смешивают 0 2 мл сыворотки с 4 8 мл 28 % - ного сульфита натрия и 1 мл эфира, затыкают резиновой пробкой и поворачивают пробирку на 180 10 раз. Затем центрифугируют 10 минут при 2000 оборотах в минуту, снимают, как выше, 3 0 мл прозрачной жидкости и смешивают в чистой пробирке с 3 0 мл биуретового реактива. Дают постоять 30 минут и фотометрируют при 540 гпц. На 9 6 мл раствора сульфата аммония NaCl осторожно надслаивают 0 4 мл сыворотки, а затем медленно смешивают осторожным нагибанием и вращением пробирки, пока помутнение не достигнет максимума через 1 - 2 минуты. Центрифугируют 30 минут при 2750 оборотах. Верхняя жидкость должна быть совершенно про - зрачна, если нет - охлаждают пробир. Верхнюю жидкость осторожно отсасывают, не взмучивая осадка, потом осторожно наклоняют пробирку и ставят ее перевернутой на несколько минут на фильтровальную бумагу для высушивания. Затем осадок растворяют в 3 мл физиологического раствора, прибавляют 3 мл биуретового реактива и через 30 минут фотометрируют. Холостой к этому определению - 3 мл воды 3 0 мл биуретового реактива. [25]
Прибавляют 0 2 мл сыворотки, смешивают и добавляют 1 мл эфира. Пробирку затыкают резиновой пробкой, сильно трясут ровно 30 секунд, а затем центрифугируют 10 минут при 3000 оборотах в минуту. Пипетку, заткнутую пальцем, осторожно проводят мимо выпавшей пластиночки глобулина и отбирают прозрачную жидкость в чистую пробирку. Отмеривают 1 5 мл этой жидкости в чистую пробирку и смешивают с 1 5 мл воды и 3 мл биуретового реактива. Дают постоять 30 минут и фотометрируют. В центрифужной пробирке смешивают 0 2 мл сыворотки с 4 8 мл 28 % - ного сульфита натрия и 1 мл эфира, затыкают резиновой пробкой и поворачивают пробирку на 180 10 раз. Затем центрифугируют 10 минут при 2000 оборотах в минуту, снимают, как выше, 3 0 мл прозрачной жидкости и смешивают в чистой пробирке с 3 0 мл биуретового реактива. Дают постоять 30 минут и фотометрируют при 540 гпц. На 9 6 мл раствора сульфата аммония NaCl осторожно надслаивают 0 4 мл сыворотки, а затем медленно смешивают осторожным нагибанием и вращением пробирки, пока помутнение не достигнет максимума через 1 - 2 минуты. Центрифугируют 30 минут при 2750 оборотах. Верхняя жидкость должна быть совершенно про - зрачна, если нет - охлаждают пробир. Верхнюю жидкость осторожно отсасывают, не взмучивая осадка, потом осторожно наклоняют пробирку и ставят ее перевернутой на несколько минут на фильтровальную бумагу для высушивания. Затем осадок растворяют в 3 мл физиологического раствора, прибавляют 3 мл биуретового реактива и через 30 минут фотометрируют. Холостой к этому определению - 3 мл воды 3 0 мл биуретового реактива. [26]