Ревертант

Cтраница 1

Ревертанты и прямые мутанты образуются под действием одного и того же агента при простых замещениях. В дальнейшем мы будем считать, что соотношение прямых и обратных мутаций 102 - 103 является нормальным и свидетельствует об обратимости действия соответствующего мутагена. В этом смысле рассмотренные нами аналоги оснований весьма типичны. Другие химические мутагены действуют на ДНК в состоянии покоя путем непосредственной химической атаки, а не через биохимические процессы. [1]

Нахождение ревертантов к дикому типу у фага Т4 несложно. Далее с помощью рекомбинации с диким типом фага мы можем отделить вторичные мутации, возвращающие фаг к дикому типу ( так называемые супрессорные мутации) от первичной мутации г - г. Размножив фаги, содержащие одну только супрес-сорную мутацию, мы можем изучить их. [2]

Проверкой гипотезы служит анализ ревертантов к дикому типу, возникающих либо спонтанно, либо под действии акридиновых красителей. [3]

Ясно, что при селекции на ревертанты мы находим количества последних в 102 - 103 раз меньшие, чем прямых мутантов. Ведь для того, чтобы прототрофный организм превратить в ауксотроф-ный, нужно повредить какой-либо цистрон в одной точке. [4]

Теперь мы можем отыскать спонтанные или индуцированные акридинами ревертанты к дикому типу, исходя из супрессорных мутантов. Снова путем генетической рекомбинации с диким фагом убеждаемся в том, что возврат к дикому типу произошел благодаря образованию второй мутации ( супрессора к супрес-сору, на этот раз со знаком) недалеко от первой. Процесс можно продолжать как угодно долго, все время отыскивая супрессорные мутанты все более высокого порядка. В итоге получается путем отбора спонтанных ревертантов и под; действием акридинов около 80 точечных мутантов. Все они по фенотипу были г, но их можно было разбить однозначно на две группы, приписав одной знак, другой - , в соответствии с чи - слом этапов при их получении. [5]

Достойна внимания отмеченная выше громадная чувствительность при селекции ревертантов. Можно наносить на чашки Петри миллионы исходных клеток, но на минимальной среде они не образуют колоний - вырастают только ревертанты. [6]

И сами оказываются малоустойчивыми и легко мутируют возвратно ( дают ревертанты) с вероятностями огромными по сравнению с обычно наблюдаемыми. [7]

Затем был найден противоположный случай: мутант Р - и его ревертант оказались разделенными на генетической карте расстоянием порядка половины протяженности всего цистрона. Соответственно были найдены в картине отпечатков пальцев 2 различных полипептидных фрагмента, измененных по сравнению с белками дикого типа. В рассматриваемом случае расстояние между измененными звеньями полипептидной цепи близко к половине ее длины. Интересной представляется возможность исправить повреждение в белке, затрагивающее его ферментативную активность, с помощью второго изменения в достаточно удаленном звене цепи. На первый взгляд, подобный факт противоречит положению об активном центре фермента. Однако такое заключение является поверхностным. Активный центр фермента содержит функциональные группы, достаточно удаленные друг от друга по полипептидной цепи, но сближаемые вследствие складывания цепи во вторичной и третичной структуре. Именно благодаря этому обстоятельству повреждение цепи, отражающееся на третичной структуре ( например, введение заряженной боковой группы), может разрушить активный центр фермента, а новое изменение, восстанавливающее первоначальную третичную структуру, может произойти совсем в другом звене цепи. [8]

Следовательно, можно воспользоваться теми же методами селекции, какие пригодны для ревертантов, - сеять на чашки Петри с минимальной средой большие количества клеток. Развиваться на этой среде будут клетки рекомбинантов, материнские же клетки развиваться не смогут: они ауксотрофны. Но возникает вопрос, как избавиться от отцовских клеток, которые могли жить на минимальной среде и передали потомству свою способность синтезировать определенные метаболиты. Чтобы их убить, избирается такой мутант отцовских клеток, который чувствителен к определенному яду, например, стрептомицину. Материнские же клетки должны быть штаммом, нечувствительным к этому яду. [9]

Схема нормировки вероятности рекомбинации в Р - цист. [10]

Следовательно, отыскивать подобные рекомбинанты мы будем на чашках Петри с минимальной средой ( без фосфата, лейцина и треонина), но со стрептомицином. Спонтанные ревертанты среди материнских клеток не смогут расти из-за неспособности к синтезу лейцина и треонина, спонтанные ревертанты среди мужских клеток погибнут из-за стрептомицина. WjcjWTir-snu так как генетическое событие, которое мы наблюдаем, сложное: это по сути дела две одновременные рекомбинации - одна в пределах большого отрезка хромосомы TL-Sm, другая в пределах сверхтонкой структуры Р - цистрона. [11]

Подобные мутанты представляют большой интерес для выяснения структуры ферментативного центра. Левинталь и Герен получили несколько десятков ревертантов, из которых часть давала фосфатазу, идентичную фосфатазе дикого типа, часть же давала активную фосфатазу, но измененную. [12]

Подсчет рекомбинантов ведется на нулевом фоне ( в принципе) благодаря тому, что оба родительских фага - мутанты rll, отсюда и прекрасная чувствительность метода. Собственно говоря, предел чувствительности ставится спонтанными ревертантами - возвратными мутациями к дикому типу. Из изученных Бензером свыше 3000 различных мутантов типа rll некоторая часть оказалась непригодной для рекомбинационных экспериментов из-за высокого уровня шумов ( большого количества спонтанных ревертантов), однако большинство мутаций, полученных облучением, действием химических мутагенов или спонтанно, оказалось вполне стабильно. Эти мутации в количестве примерно 2000 и были расположены на генетической карте в линейной последовательности. [13]

В некоторых случаях приходится вести селекцию возвратных мутаций, когда организмы, утратившие по сравнению с диким типом какую-либо биохимическую функцию, приобретают ее вновь. Такие клетки, мутировавшие обратно к дикому типу, носят название ревертантов. [14]

Схема нормировки вероятности рекомбинации в Р - цист. [15]

Страницы: 1 2 3