Ревертант
Cтраница 2
Следовательно, отыскивать подобные рекомбинанты мы будем на чашках Петри с минимальной средой ( без фосфата, лейцина и треонина), но со стрептомицином. Спонтанные ревертанты среди материнских клеток не смогут расти из-за неспособности к синтезу лейцина и треонина, спонтанные ревертанты среди мужских клеток погибнут из-за стрептомицина. WjcjWTir-snu так как генетическое событие, которое мы наблюдаем, сложное: это по сути дела две одновременные рекомбинации - одна в пределах большого отрезка хромосомы TL-Sm, другая в пределах сверхтонкой структуры Р - цистрона. [16]
Достойна внимания отмеченная выше громадная чувствительность при селекции ревертантов. Можно наносить на чашки Петри миллионы исходных клеток, но на минимальной среде они не образуют колоний - вырастают только ревертанты. [17]
Эти замены вызваны изменением в каждом случае только одного основания в кодирующем триплете. При последующей мутации глутамин: ( УГА) может быть заменен на валин ( УГУ), и при этом получается частичный ревертант, или на аланин ( УГЦ) или глицин ( УГГ) - полные ревертанты. Или же ( во втором случае) аргинин может быть замещен на серии ( УЦУ) или глицин ( УГГ), что опять-таки приведет к полному восстановлению исходного типа. [18]
Мутантов, у которых изменена чувствительность какого-нибудь аллостерического фермента к эффектору, можно также выделять с помощью совершенно иного принципа, а именно как ревертантов к ауксотрофии. При этом поступают следующим образом. Сначала выделяют мутантов с дефектом регуляции, ауксотрофных в отношении метаболита, который хотят получить как конечный продукт, накапливающийся в среде. Затем среди этих ауксотрофных мутантов отбирают таких, у которых неспособность к синтезу данного метаболита обусловлена дефектом в аллостериче-ском ферменте соответствующего пути биосинтеза. После этого из полученной мутантной популяции выделяют прототрофных ревертантов, которые не нуждаются в этом конечном продукте, так как сами спо-собнц его синтезировать. Среди ревертантов отбирают тех, которые выделяют нужный продукт в среду. Их можно выявить биоавтографическим методом ( разд. [19]
Для мутаций класса 1, называемых также точечными мутациями, характерна высокая частота реверсии. В случае мутаций класса 2, к которым относятся также мутации со сдвигом рамки ( см. рис. 15.4), ревер-танты редки, а после мутаций класса 3 ( за некоторыми исключениями) ревертанты не появляются. [20]
Эти замены вызваны изменением в каждом случае только одного основания в кодирующем триплете. При последующей мутации глутамин: ( УГА) может быть заменен на валин ( УГУ), и при этом получается частичный ревертант, или на аланин ( УГЦ) или глицин ( УГГ) - полные ревертанты. Или же ( во втором случае) аргинин может быть замещен на серии ( УЦУ) или глицин ( УГГ), что опять-таки приведет к полному восстановлению исходного типа. [21]
Было установлено, что мутации в этой области, вызываемые акридиновыми красителями, состоят в выпадении, делеции, нуклеотидов и в их добавлении. Мутанты г размножаются только на 5-штаммах, образуя резко очерченные бляшки. Генетический анализ показал, что такие ревертанты возникают не в результате обратной мутации r - - w, но вследствие появления второй супрессорной мутации w - - г вблизи первой. Каждая из двух мутаций порознь приводит к утрате способности синтезировать соответствующий белок, но сочетание двух мутаций в одном гене эту способность восстанавливает. Всего было изучено около 80 r - мутантов, в том числе двойные и тройные их комбинации - супрессоры супрессоров и супрессоры супрессоров супрессоров. Если исходная мутация г есть, то ее супрессор - , и наоборот. [22]
Мутантные фаги г размножаются только на Б - штам-мах, образуя резко ограниченные бляшки. Мутанты FCO, индуцируемые профлавином, относятся к типу л Они обладают способностью спонтанно ревертировать, возвращаться к дикому типу да. Генетический анализ показал, что такие ревертанты возникают не в результате обратной мутации r - w, но вследствие появления второй супрессорной мутации вблизи первой мутации w - г. Супрессоры относятся к тому же фенотипу г, что и супрессируемые ими мутации. Каждая из двух мутаций порознь приводит к утрате способности синтезировать соответствующий белок, но сочетание двух мутаций в одном цистроне эту способность восстанавливает. Всего было изучено около 80 r - мутантов, в том числе двойные и тройные их комбинации - супрессоры супрессоров и супрессоры супрессоров супрессоров. Если исходная мутация г есть то ее супрессор - и наоборот. [23]
 |
Октеты кодонов. [24] |
Исследование мутаций сдвига рамки непосредственно свидетельствует о вырождении кода. Если код не вырожден, то оба кодона для Гис в ревертанте должны быть одинаковыми. [25]
Получить ауксотрофные мутанты, способные накапливать конечные продукты неразветвленных цепей биосинтеза, например L-аргинин, невозможно. В таких случаях приходится отбирать мутанты с частично нарушенной регуляцией биосинтеза, что позволяет получить повышенный выход конечного продукта. Такие мутанты известны под названием регуляторных; их отбирают по устойчивости к аналогам аминокислот или же средин ревертантов ауксотрофов. В основе использования аналогов-аминокислот лежит их сходство с природными аминокислотами. Они ингибируют рост бактерий, но этот эффект может быть уменьшен путем добавления соответствующей природной аминокислоты. Таким образом, аналоги выступают в роли искусственных, работающих по принципу обратной связи, ингибиторов-ферментов, обеспечивающих биосинтез природных аминокислот. Появление мутантов, устойчивых к этим ложным ингибиторам, означает, что регуляторные ферменты соответствующего пут № обмена становятся у них нечувствительными к аналогу. Так, серусодержащий аналог лизина 5 - ( 2-аминоэтил) - Ь - цистеин является у Brevibacterium flauum ложным, действующим по принципу обратной связи ингибитором аспартокиназы. Устойчивые к его действию мутанты вырабатывают фермент, который в 150 раз менее чувствителен к ингибированию по механизму обратной связи, чем фермент исходного штамма, и в результате продуцируют до 33 г / л лизина. [26]
Подсчет рекомбинантов ведется на нулевом фоне ( в принципе) благодаря тому, что оба родительских фага - мутанты rll, отсюда и прекрасная чувствительность метода. Собственно говоря, предел чувствительности ставится спонтанными ревертантами - возвратными мутациями к дикому типу. Из изученных Бензером свыше 3000 различных мутантов типа rll некоторая часть оказалась непригодной для рекомбинационных экспериментов из-за высокого уровня шумов ( большого количества спонтанных ревертантов), однако большинство мутаций, полученных облучением, действием химических мутагенов или спонтанно, оказалось вполне стабильно. Эти мутации в количестве примерно 2000 и были расположены на генетической карте в линейной последовательности. [27]
Ясно, что при селекции на ревертанты мы находим количества последних в 102 - 103 раз меньшие, чем прямых мутантов. Ведь для того, чтобы прототрофный организм превратить в ауксотроф-ный, нужно повредить какой-либо цистрон в одной точке. Поэтому ревертанты достаточно редки, однако легко наблюдаемы из-за большой чувствительности метода селекции. [28]
Щелочная фосфатаза имеет молекулярный вес 80 000 и состоит из 2 одинаковых блоков, по 380 аминокислотных звеньев каждый. Блоки соединены ионными связями. При гидролизе трипсином получается 35 полипептидов, которые могут быть хорошо разделены электрофорезом и хроматографией. Исследование фосфатазы ревертантов показало, что она отличается от обычного белка из клеток дикого типа часто 1, изредка 2 аминокислотными звеньями. Мутация Р - - Р - приводит к клеткам, неспособным синтезировать активную щелочную фосфатазу. С помощью генетических экспериментов по рекомбинации место повреждения в цепи ДНК установлено с точностью до 2 - 3 нуклеотидных звеньев. Когда возникает возвратная мутация, происходит новая замена нуклеотида в том же звене или рядом и возникает опять осмысленное сочетание, но необязательно то же самое, какое было до первой мутации. Полипептидная цепь синтезируется на матрице, но одно аминокислотное звено оказывается измененным. [29]
Теперь мы можем отыскать спонтанные или индуцированные акридинами ревертанты к дикому типу, исходя из супрессорных мутантов. Снова путем генетической рекомбинации с диким фагом убеждаемся в том, что возврат к дикому типу произошел благодаря образованию второй мутации ( супрессора к супрес-сору, на этот раз со знаком) недалеко от первой. Процесс можно продолжать как угодно долго, все время отыскивая супрессорные мутанты все более высокого порядка. В итоге получается путем отбора спонтанных ревертантов и под; действием акридинов около 80 точечных мутантов. Все они по фенотипу были г, но их можно было разбить однозначно на две группы, приписав одной знак, другой - , в соответствии с чи - слом этапов при их получении. [30]
Страницы: 1 2 3