Cтраница 2
Реже применяется гидролиз под действием оснований, который в относительно мягких условиях ( растворы гидроокисей щелочных и щелочноземельных металлов, соды, бикарбоната) приводит к разрыву лишь некоторых типов гликозидных связей ( см. гл. Этим путем также трудно получить фрагменты, содержащие узловую гликопептидную связь; существенно, однако, что именно некоторые типы такой связи чувствительны к подобным воздействиям. Это в особенности относится к О-гликозидной связи и, очевидно, к слож-ноэфирной и О-ацилгликозидной связям. Распад под действием оснований в сочетании с кинетическими или полукинетическими измерениями используется сейчас для доказательства наличия О-гликозидной связи в гликопротеинах18 38 и в будущем позволит, по-видимому, создать один из методов их избирательного гидролиза. В последнее время широко используется гидролиз разбавленными растворами щелочей в присутствии небольших количеств NaBH438 39 40; в этом случае концевые восстанавливающие моносахаридные остатки отщепляюдихся олигосахаридов восстанавливаются, что предохраняет их от деструкции под действием щелочи и дает возможность выделить и подвергнуть исследованию. [16]
Природа связи между углеводами и пептидными цепями в гликопротеинах точно не установлена. Предполагали, в частности, что в гликопротеинах имеются сложноэфирные, связи, образованные гидроксильными группами Сахаров и карбоксильными группами аминокислотных остатков, а также амидные связи, в образовании которых принимает участие карбоксильная группа аминокислоты и аминогруппа гексозаминов или гликозилами-нов. Не исключена, кроме того, возможность существования О-гликозидных связей с участием гидроксилов серина или треонина и N-гликозидных связей, возникших за счет аминогрупп остатков аминокислот. Гликопептиды со связями последнего типа могут претерпевать перегруппировку Амадори. Для выяснения этих вопросов синтезировали различные модельные соединения, построенные главным образом из остатков P-D-ГЛЮКОЗЫ или о-глюкозамина и аминокислоты, ди - или трипептида. [17]
Природа связи между углеводами и пептидными цепями в гликопротеинах точно не установлена. Предполагали, в частности, что в гликопротеинах имеются сложноэфирные связи, образованные гидроксильными группами Сахаров и карбоксильными группами аминокислотных остатков, а также амидные связи, в образовании которых принимает участие карбоксильная группа аминокислоты и аминогруппа гексозаминов или гликозилами-нов. Не исключена, кроме того, возможность существования О-гликозидных связей с участием гидроксилов серина или треонина и N-гликозидных связей, возникших за счет аминогрупп остатков аминокислот. Гликопептиды со связями последнего типа могут претерпевать перегруппировку Амадори. Для выяснения этих вопросов синтезировали различные модельные соединения, построенные главным образом из остатков p - D-глюкозы или о-глюкозамина и аминокислоты, ди - или трипептида. [18]
Поскольку многие гликопротеины содержат лишь небольшое количество углеводов, для их анализа могут быть использованы протеолитические ферменты ( например, проназы); при обработке этими ферментами образуются гликопептиды с небольшим числом аминокислотных остатков, к которым присоединены интактные углеводные звенья. Такие гликопептиды анализируют [188] классическими методами периодатного окисления [189] и метилирования, а также последовательным ферментативным гидролизом ( см. разд. Установлено, что осуществляются только два типа такой связи: О-гликозидная связь с серином, треонином, гидроксипролином и гидроксилизином, и Af-гликозидная связь с аспарагином. Показано, что в образовании таких связей могут участвовать только пять моносахаридов: L-арабиноза, D-ксилоза, D-галактоза, 2-ацетамидо - 2-дезокси - Д - глюкоза и 2-ацетамидо - 2-дезокси - /) - галактоза. [19]
На основании полученных данных был сделан вывод, что диса-харидные цепи привязаны ацилгликозидной связью через карбоксильные группы двухосновных аминокислот. Однако позднее было установлено34 43, что при протеолизе муцинов образуется смесь низкомолекулярных пептидов, причем данные о соотношении моносахаридов, оксикис-лот и двухосновных кислот показали, что главным типом связи может быть лишь О-гликозидная связь через оксиаминокислоты. В настоящее время большинство исследователей считает, что основным видом связи вмуци-на х является О-гликозидная связь, хотя присутствие дисахаридных группировок, связанных О-ацилгликозидной связью, не исключается. [20]
Реже применяется гидролиз под действием оснований, который в относительно мягких условиях ( растворы гидроокисей щелочных и щелочноземельных металлов, соды, бикарбоната) приводит к разрыву лишь некоторых типов гликозидных связей ( см. гл. Этим путем также трудно получить фрагменты, содержащие узловую гликопептидную связь; существенно, однако, что именно некоторые типы такой связи чувствительны к подобным воздействиям. Это в особенности относится к О-гликозидной связи и, очевидно, к слож-ноэфирной и О-ацилгликозидной связям. Распад под действием оснований в сочетании с кинетическими или полукинетическими измерениями используется сейчас для доказательства наличия О-гликозидной связи в гликопротеинах18 38 и в будущем позволит, по-видимому, создать один из методов их избирательного гидролиза. В последнее время широко используется гидролиз разбавленными растворами щелочей в присутствии небольших количеств NaBH438 39 40; в этом случае концевые восстанавливающие моносахаридные остатки отщепляюдихся олигосахаридов восстанавливаются, что предохраняет их от деструкции под действием щелочи и дает возможность выделить и подвергнуть исследованию. [21]
Выделение агглютинина из зародышей пшеницы [34] на сефарозе с ковалентно связанным 2-ацетамидо - М - ( е-аминокапро-нил - 2-дезокси - 3-о-глюкопиранозиламином является примером использования специфического сорбента, приготовленного ковалент-ным присоединением моносахарида к нерастворимому носителю. Хорейши и Коцоурек [27] приготовили ряд специфических сорбентов для выделения фитогемагглютининов из различных источников путем сополимеризации алкенил - О-гликозидов с акриламидом и К М - метиленбисакриламидом. Таким способом полученные гидрофильные гели содержат сахара, связанные О-гликозидными связями с алкильными боковыми цепями матрицы. [22]
Для установления строения гликозидов, содержащих один моносахаридный остаток, необходимо установить природу моносахарида, строение агликона, размер окисного цикла моносахаридного остатка и конфигурацию гликозидной связи. Для решения первой задачи проводят гидролиз гликозида, после чего идентифицируют образовавшийся моносахарид ( см. гл. Для полифункциональных агликонов задача осложняется тем, что при этом возникает необходимость выяснения места присоединения углеводного остатка к агликону. Кроме того, некоторые природные агликоны ( например, агликоны сердечных гликозидов) лабильны в кислой среде, что затрудняет получение неизмененного агликона при гидролизе. В таких случаях прибегают к ферментативному гидролизу ( см. стр. Многие природные гликозиды содержат несколько моносахаридных остатков, соединенных друг с другом О-гликозидными связями. Установление строения таких соединений включает помимо решения перечисленных задач установление строения олигосахаридной цепи ( или цепей) методами, применяемыми в химии олигосахаридов ( см. гл. Для определения размера окисного цикла моносахаридного остатка применяют два метода: метилирование и перио-датное окисление. Первый метод заключается в получении метиловых эфиров гликозидов и их последующем гидролизе; метилированию подвергаются все спиртовые гидроксилы моносахаридного остатка, за исключением того, который принимал участие в образовании окисного цикла исходного гликозида. Поэтому установление положения метоксильных групп в полученном при гидролизе метилированном моносахариде позволяет установить, который из спиртовых гидроксилов участвовал в образовании цикла. [23]