Cтраница 2
При данном виде хроматографии используется способность материалов с контролируемой пористостью сортировать и разделять компоненты смеси в соответствии с размерами и формой их молекул. Для осуществления процесса гель-хроматографии используются гели поперечно-емкостного декстрана ( сефадексы и сефакрилы), поперечно-сшитые полиакриламидные гранулы ( биогели), агарозные гели с выраженными в них цепями акриламидного полимера ( ультрагели) и более жесткие поперечно-сшитые агарозы ( CL-агарозы и сефакрилы - S), с помощью которых можно быстро разделить макромолекулы в соответствии с их размером. Степень удерживания растворенного вещества на колонке зависит от его способности проникать в поры геля. [16]
Как видно из представленных данных, сефакрилы пригодны для фракционирования или очистки крупных макромолекул, но не могут заменить сефадексы малых номеров, пригодные для работы с относительно низкомолекулярными объектами. Как будет видно из сопоставления с данными, приведенными ниже, сефакрилы могут успешно конкурировать с гелями агарозы. Пористость сефакрила S-1000 Superfine - примерно такая же, как у 0 5 % - ной агарозы, а сефакрила S-400 Superfine - как у 5 % - ной. [17]
Структура, а также химические и адсорбционные свойства материала этих матриц ( декстран, сшитый метиленбисакри-ламидом) были описаны выше. Главным его достоинством - по сравнению с сефадексом - является жесткость, благодаря чему гель-фильтрацию на сефакрилах, в том числе на крупнопористых, можно вести при относительно больших скоростях элюции. [18]
Жесткость сефакрилов, в том числе и наиболее крупнопористых, позволяет использовать их в водных буферах со скоростями элюции порядка 40 мл / см2 - ч и не слишком сильно снижать их при работе с вязкими элюеитами. Так, сефакрил S-400 не сжимается при элюции колонки 6 М раствором гуанидинхлорпда со скоростью 20 мл / см2 - ч, а сефакрил S-1000 позволяет с такой же скоростью вести элюцию чистым формамидом. [19]
При данном виде хроматографии используется способность материалов с контролируемой пористостью сортировать и разделять компоненты смеси в соответствии с размерами и формой их молекул. Для осуществления процесса гель-хроматографии используются гели поперечно-емкостного декстрана ( сефадексы и сефакрилы), поперечно-сшитые полиакриламидные гранулы ( биогели), агарозные гели с выраженными в них цепями акриламидного полимера ( ультрагели) и более жесткие поперечно-сшитые агарозы ( CL-агарозы и сефакрилы - S), с помощью которых можно быстро разделить макромолекулы в соответствии с их размером. Степень удерживания растворенного вещества на колонке зависит от его способности проникать в поры геля. [20]
Получается очень жесткий гель, пористость которого легко контролировать. Благодаря своей жесткости сефакрил может быть использован при значительно больших скоростях элюции, чем сефадекс с такой же пористостью. Сефакрил поставляется в виде суспензии набухших гранул с размерами 40 - 105 мкм. Подробные данные об этих матрицах изложены в гл. [21]
Как видно из представленных данных, сефакрилы пригодны для фракционирования или очистки крупных макромолекул, но не могут заменить сефадексы малых номеров, пригодные для работы с относительно низкомолекулярными объектами. Как будет видно из сопоставления с данными, приведенными ниже, сефакрилы могут успешно конкурировать с гелями агарозы. Пористость сефакрила S-1000 Superfine - примерно такая же, как у 0 5 % - ной агарозы, а сефакрила S-400 Superfine - как у 5 % - ной. [22]
Матрицы на основе геля агарозыт химически сшитого дибромпропанолом ( см. гл. Области фракционирования и графики селективности - практически такие же, как и для соответствующих типов обычной сефарозы. Однако сшивка придает сефарозе большую жесткость, сопоставимую с жесткостью сефакрила. Максимально допустимые скорости течения элюента при использовании такой сефарозы в водных буферах увеличиваются в 1 5 раза, а при гель-фильтрации в 6 М растворе гуанидиихлорида - почти в 4 раза. Химическая стойкость модифицированной матрицы, особенно в щелочной области, заметно возрастает. [23]
Сефароза поставляется в виде суспензии, подсушивания которой не следует допускать ( см. гл. Разброс диаметров гранул столь же велик, как у сефадексов. Гели сефарозы жесткие, но несколько уступают в этом отношении сефакрилам. Гранулы сефарозы отличаются хрупкостью и сравнительно легко крошатся при неосторожном перемешивании. [24]
Как видно из представленных данных, сефакрилы пригодны для фракционирования или очистки крупных макромолекул, но не могут заменить сефадексы малых номеров, пригодные для работы с относительно низкомолекулярными объектами. Как будет видно из сопоставления с данными, приведенными ниже, сефакрилы могут успешно конкурировать с гелями агарозы. Пористость сефакрила S-1000 Superfine - примерно такая же, как у 0 5 % - ной агарозы, а сефакрила S-400 Superfine - как у 5 % - ной. [25]
Во всех случаях иммобилизованная ДНК снималась с матрицы довольно быстро ( 10 - 20 % в сутки) - при 45 в течение первых двух-трех дней. Это обстоятельство необходимо иметь в виду, так как снявшаяся с матрицы ДНК может весьма эффективно уводить из колонки очищаемую комплементарную ДНК или РНК, тем более что процесс связывания за счет гибридизации занимает иногда несколько дней. Существенные различия между тремя изучав-щимися типами сорбентов имеются в их дальнейшем поведении. Сорбенты на основе BrCN-активированной сефарозы ( или сефакрила) и диазобензилоксиметилсефакрила продолжали терять ДНК в течение многих дней после предынкубации, в то время как сорбент на основе диазофенилтиоэфира сефакрила, быстро утратив в ходе предынкубации до 50 % исходно фиксированной ДНК, далее оставался неизменным. По этой причине для ковалентного закрепления ДНК авторы выбрали последний из трех сорбентов. [26]
Во всех случаях иммобилизованная ДНК снималась с матрицы довольно быстро ( 10 - 20 % в сутки) - при 45 в течение первых двух-трех дней. Это обстоятельство необходимо иметь в виду, так как снявшаяся с матрицы ДНК может весьма эффективно уводить из колонки очищаемую комплементарную ДНК или РНК, тем более что процесс связывания за счет гибридизации занимает иногда несколько дней. Существенные различия между тремя изучав-щимися типами сорбентов имеются в их дальнейшем поведении. Сорбенты на основе BrCN-активированной сефарозы ( или сефакрила) и диазобензилоксиметилсефакрила продолжали терять ДНК в течение многих дней после предынкубации, в то время как сорбент на основе диазофенилтиоэфира сефакрила, быстро утратив в ходе предынкубации до 50 % исходно фиксированной ДНК, далее оставался неизменным. По этой причине для ковалентного закрепления ДНК авторы выбрали последний из трех сорбентов. [27]