Cтраница 4
В некоторых случаях обнаружено, что при использовании свежеприготовленных сорбентов теряется часть активности выделяемого вещества, вероятно, из-за его необратимой сорбции. Так, Го-рецкий и др. [12] описали изменчивость конъюгата пенициллин - сефароза. Аминобензилпенициллин, присоединенный к сефарозе брО Мциановым методом, дает очень устойчивый конъюгат, который сохраняет свою способность специфически адсорбировать D-ала-нинкарбоксипептидазу даже после хранения в воде в присутствии 0 02 % азида натрия при 4 С в течение нескольких месяцев. Насыщение геля неочищенным ферментом ( для чего берется - 10-кратный избыток фермента по сравнению с используемым для обычной очистки) превращает пенициллин-сефарозу в нормальный обратимый сорбент, пригодный для аффинной хроматографии D-аланинкарбоксипептидазы. Этот эффект насыщения высоко специфичен, и никакой другой инертный белок, например бычий сывороточный альбумин, не может заменить D-аланинкарбок-сипептидазу в необратимой сорбции. Кроме того, показано, что при хранении гелей при 4 С некоторые из них, характеризующиеся необратимой сорбцией, превращались в сорбенты, пригодные для нормальной аффинной хроматографии. Это можно объяснить уменьшением числа высокоактивных сорбирующих центров на поверхности геля, вследствие чего связывание фермента этими модифицированными специфическими сорбентами становится обратимым. [46]
Для того, чтобы получить более высокий выход, Пенски и Маршалл [30] проводили сорбцию в статических условиях: нормальная человеческая сыворотка в течение ночи перемешивалась с иммобилизованным аффинным лигандом. Такая комбинация статического и динамического ( на колонке) методов часто встречается в аффинной хроматографии. Тем самым увеличивается не только время контакта выделяемых веществ с присоединенным аффинным лигандом, но и время, необходимое для точной ориентации связывающих участков. При хроматографии в колонках увеличение времени контакта выделяемого вещества с иммобилизованным аффинным лигандом достигается путем остановки на некоторое время потока через колонку после нанесения образца. Манен и Рассел [26] установили, что если в ходе аффинной хроматографии де-карбоксилазы 5-аденозил - Ь - метионина поток растворителя через колонку сефарозы с присоединенным га-хлормеркурибензоатом не останавливать на 2 ч, фермент будет элюироваться через несколько фракций и должная очистка не будет достигнута. Достаточно низкая скорость потока через колонку со специфическим сорбентом является наиболее важным моментом при выделении высокомолекулярных веществ, в особенности если они присутствуют в высоких концентрациях. Скорость потока, концентрация наносимого образца и время уравновешивания обсуждались в разд. [47]
Приблизительно третья его часть элюировалась тем же самым буфером, но почти 20 мг белка оставались связанными, несмотря на интенсивную промывку, и могли быть отмыты, только когда возрастала ионная сила элюирующего раствора. Часть оставшегося на колонке белка отмывается 0 01 М трис - НС1 - буфером, однако большая часть белка отмывается 0 01 М трис - НС1 - буфером, содержащим 0 1 моль / л хлорида натрия, и очень небольшое количество белка - 0 1 М трис - НС1 - буфером, содержащим 1 0 моль / л хлорида натрия. Эти результаты указывают на то, что часть белка освобождается на каждом уровне ионной силы раствора, в то время как остальная часть остается необратимо связанной в данных условиях. Фракционирование одного и того же белка Хофсти объясняет негомогенностью связывающих центров адсорбента. Элюирование этого небольшого количества белка при помощи градиента ионной силы ( хлорид натрия) происходит растворами с концентрацией соли, соответствующей элюенту, снимающему с колонки последние остаточные количества прочно адсорбированного белка, в случае, когда на колонку наносилось большое количество овальбумина. Эти результаты означают, что некоторые сильносвязывающие центры занимаются белком в первую очередь и что некоторые другие участки с пониженной аффинностью занимаются при нанесении на колонку большего количества белка. Такие же результаты были получены и для других белков и красителя понсо S. Из этого следует, что при нанесении на колонку небольших количеств белков они связываются со специфическими сорбентами более гомогенно, чем при нанесении больших. Это может означать, что уменьшение количества наносимого белка способствует использованию преимущественно одного типа связывающих центров адсорбента. [48]