Cтраница 2
В работе Бойенса и Мак-Коннелла 158 ] обнаружено, что 2 2 5 5-тетраметил - З - малеимидопирролидин-1 - оксил в растворе реагирует без участия неспаренного электрона как с гемоглобином, так и с оксигемоглобином, показывая в первом случае спектр ЭПР слабо иммобилизованных свободных радикалов, а во втором - спектр ЭПР, соответствующий сильной иммобилизации. Авторам удалось доказать, что спин-метка в обоих случаях реагирует с сульфгид-рильной группой 93 аминокислотного остатка ( 5-цепи гемоглобина. [16]
Поскольку беспорядочного движения молекул белка в растворе недостаточно для эффективного усреднения анизотропного взаимодействия, полученные результаты свидетельствуют о том, что небольшая часть свободных радикалов фиксирована относительно жесткой третичной структуры сывороточного альбумина. Это явление получило название сильной иммобилизации спин-метки, в отличие от слабой иммобилизации, когда компоненты СТС спектра ЭПР лишь слегка уширяются. [17]
В другой работе [ 431 в качестве свободнорадикальной метки сывороточного альбумина был использован 2 2 5 5-тетраметил - З - малеимидопирролидин-1 - оксил. После проведения реакции, в результате которой спин-метка соединилась с сывороточным альбумином ( рис. 37, а), наблюдалось наложение двух сигналов ЭПР, относившихся к сильно и слабо иммобилизованным свободным радикалам. При рН 2 1 компоненты широкого сигнала ЭПР отсутствовали, а амплитуда узкого сигнала ЭПР увеличилась примерно вдвое. [18]
Нитроксильные радикалы исключительно устойчивы, и для них известно множество производных. В биологии они широко применяются в качестве спин-меток. При этом синтезируют нитроксильное производное какой-либо биомолекулы таким образом, чтобы нитроксильная группа была известным образом жестко ориентирована относительно оси молекулы. Полученное соединение вводят в биологическую систему или систему, моделирующую некоторую ее часть. [19]
На основе LVII и LVIII были получены спин-меченые аминокислоты и пептиды. Однако недостаточная информативность спектров ЭПР этих радикалов существенно снижает возможности их использования в качестве спин-меток. [20]
Мы уже видели на рис. 9 - 18, как меняется спектр ЭПР имин-оксильного радикала по мере уменьшения скорости вращения. Исходя из параметров спектра ЭПР, можно грубо оценить скорость вращения. Движение спин-метки, связанной с активным центром фермента или находящейся вблизи него, затруднено. Снижение скорости вращения отражается в спектре ЭПР ( разд. Нанограммовые количества опиума ( или продуктов его обмена) в капле мочи смещают равновесие между свободной и связанной спин-метками в такой мере, что это смещение уже можно обнаружить методом ЭПР. [21]
Спин-метка чувствительна к своему окружению, ее спектр ЭПР зависит от конформационного состояния биополимера. Подвижность метки связана с локальной подвижностью биополимера и подвижностью его молекулы как целого. С помощью спин-меток установлены важные особенности строения и динамики белковых молекул. Эти методы весьма эффективны и при изучении биологических мембран. [22]
Ряд фактов свидетельствует о конформационных переходах в мембранах. В мембранах наблюдаются фазовые переходы - плавление липидов. С помощью спин-меток в суспензии плазматических мембран, выделенных из фибробластов мыши, найдены температуры латерального разделения фаз в липидах. Для внешнего монослоя липидов такие переходы наблюдаются при 15 и 31 С, для внутреннего - при 21 и 37 С. [23]
Прямую информацию о конформационных свойствах мембран дает изучение наблюдаемых в них фазовых переходов, которые можно трактовать как плавление липидов. Переходы наблюдаются методами флуоресценции, светорассеяния, дилатометрии. С помощью спин-метки в суспензии плазматических мембран, выделенных из фибробластов мыши, найдены характеристические температуры латерального разделения фаз в липидах. [24]
Исходя из того, что одна молекула белка связывала от одного до двух свободных радикалов, авторы предположили, что в сывороточном альбумине имеется две различные аминогруппы, реагирующие с иминоксильными свободными радикалами. Другая аминогруппа, расположенная в глубине белковой глобулы, при связывании со спин-меткой дает спектр ЭПР сильно иммобилизованных свободных радикалов. В последнем случае свободный радикал, связанный кова-лентной связью с молекулой белка, гидрофобно взаимодействует с близлежащим участком полипептидной цепи. При кислотно-щелочной денатурации сывороточного альбумина, а также при переваривании спин-меченого белка пепсином широкие компоненты спектра ЭПР сильно иммобилизованных свободных радикалов исчезали, и сигнал ЭПР исследуемой системы приближался по своим параметрам к спектру ЭПР описанного ( стр. [25]
Стабильные иминоксилы могут оказаться полезными при исследовании фермент-субстратных комплексов. После установления равновесия между ферментом и субстратом в реакциях гидролиза под действием а-химотрипсина, фермент-субстратный комплекс распадается на п-нитрофенол и ацилкоэнзим, который в свою очередь выделяет субстрат и кислоту. Берлинер и Мак-Коннелл [50] использовали в качестве субстрата для этой реакции н-нитрофе-ниловый эфир 2 2 5 5-тетраметил - 3-карбоксипирролидин - 1-окси-ла и им удалось выделить небольшое количество парамагнитного ацилкоэнзима. Спектр ЭПР фермент-субстратного комплекса свидетельствовал о том, что спин-метка жестко фиксирована относительно молекулы фермента. При рН 6 8 комплекс распадался и появлялся сигнал ЭПР, характерный для свободной иминоксиль-ной метки в растворе. [26]
В углеводородных средах обычно расщепление на 1 - 2 Гс меньше, чем в полярных растворителях. В полярной среде - фактор примерно на 0 0005 больше, чем в неполярной. Таким образом, измерение этих параметров позволяет установить природу окружения спин-метки в биологической системе. [27]
Мы уже видели на рис. 9 - 18, как меняется спектр ЭПР имин-оксильного радикала по мере уменьшения скорости вращения. Исходя из параметров спектра ЭПР, можно грубо оценить скорость вращения. Движение спин-метки, связанной с активным центром фермента или находящейся вблизи него, затруднено. Снижение скорости вращения отражается в спектре ЭПР ( разд. Нанограммовые количества опиума ( или продуктов его обмена) в капле мочи смещают равновесие между свободной и связанной спин-метками в такой мере, что это смещение уже можно обнаружить методом ЭПР. [28]