Cтраница 1
Нерастворимый субстрат, получаемый на основе порошка кожи, ковалентно меченного ре-мазолбриллиантовым синим. Краситель определяют по поглощению при 595 нм после обработки субстрата про-теазами. Присутствие альбумина не оказывает влияния. [1]
Важной особенностью процесса ферментативной деструкции целлюлозы и других полисахаридов является то, что он осуществляется на поверхности нерастворимого субстрата, причем реакционная способность субстрата является функцией ряда его физи-кохимических и структурных свойств, и, как правило, убывает в ходе деструкции. Специфика в данном случае заключается в том, что субстрат имеет упорядоченную ( кристаллическую) структуру, во многих случаях содержит в своем составе сопутствующие вещества ( в первую очередь лигнин), которые служат физическим барьером, затрудняющим доступ ферментов к глюкозидным связям. Важную роль играют размеры поверхности, доступной молекулам ферментов, а также адсорбционные и диффузионные процессы, предшествующие и сопровождающие гидролитическое превращение нерастворимых субстратов. [2]
Появление целлюлаз в культуральной жидкости обычно запаздывает по сравнению с образованием биомассы и соответствует логарифмической фазе, когда в среде остается мало нерастворимого субстрата, а максимума может достигать уже в фазе отмирания культуры, когда в результате лизиса клеток в раствор выходят внутриклеточные и связанные с клеточной стенкой ферменты. [3]
Ван В ь е т, Клесов А. А. Адсорбция цел-люлолитических ферментов на целлюлозе и кинетика действия адсорбированных ферментов: два типа взаимодействия ферментов с нерастворимым субстратом. [4]
В зависимости от места их участия в реакции ферменты подразделяют на эндоферменты, действующие внутри клетки и управляющие процессами внутреннего метаболизма, и э к з о - ферменты, выделяемые клеткой с целью разрушения нерастворимого субстрата до растворимых продуктов, способных диффундировать через клеточную мембрану. [5]
Экспериментальное решение такого рода задач предполагает: контролируемое с точки зрения отдельных компонентов и их множественных форм культивирование продуцента; выделение, тонкое фракционирование и получение в высокоочищенном состоянии множественных форм целлюлолитических ферментов; детальную характеристику компонентов по биохимическим свойствам, субстратной специфичности; изучение кинетики и механизма действия ферментов как индивидуально, так и в смеси с другими компонентами во всем диапазоне по глубине конверсии нерастворимого субстрата. [6]
Можно отметить, что иммобилизация гемицеллюлаз на нерастворимых носителях позволяет применять несложный реактор в виде колонн, наполненных нерастворимым иммобилизованным ферментом, через который протекает раствор ГМЦ или олпгосаха-ров. В случае ФГ нерастворимых субстратов, что имеет место при гидролизе всей делигнифицированной биомассы или целлюлозы, этот принцип не может быть применен, так как иммобилизация ферментов на твердом носителе не обеспечивает эффективный контакт фермента с поверхностью твердого субстрата. [7]
Использование целлюлозы обусловлено взаимодействием с нерастворимым гидрофильным субстратом, представляющим структурно-организованные волокна. Отсюда следуют необходимость физического контакта клеток с нерастворимым субстратом и обрастание его биопленкой. [8]
Рассмотрим явление синергизма на примере ферментов целлюлазного комплекса T. Кроме того, Ксин зависит от начальной концентрации нерастворимого субстрата. [9]
Большинство из этих моделей основаны на теории Михаэлиса-Ментен с учетом специфики гетерогенной системы, включающей нерастворимый субстрат и мультиферментный целлюлазный комплекс. [10]
Приведенные выше методы качественного и количественного определения Сахаров, методы определения степени солюбилизации целлюлозы позволяют определять активность целлюлазного комплекса с использованием различных растворимых и нерастворимых субстратов. При использовании растворимой КМ-целлюлозы определяют так называемую КМЦ-азную или Сг-активность комплекса, микрокристаллической целлюлозы ( авицела) - авицелазную, хлопкового волокна - так называемую Ci-активность. Все эти активности характеризуют активность всего комплекса. Как правило, активность определяется по одной точке. Это оправдано при массовом тестировании препаратов, скрининге продуцентов. Однако при получении количественной характеристики препарата метод может приводить к значительным ошибкам. Это может значительно искажать получаемые результаты в силу диффузионных ограничений При определении активности с использованием нерастворимой целлюлозы необходимо учитывать и возможную нелинейную зависимость начальной скорости гидролиза целлюлозы от концентрации субстрата. [11]
Определение активности цел л юл аз с использованием окрашенной целлюлозы. Приведенные выше методы качественного и количественного определения Сахаров, методы определения степени солюбилизации целлюлозы позволяют определять активность целлюлазного комплекса с использованием различных растворимых и нерастворимых субстратов. При использовании растворимой КМ-целлюлозы определяют так называемую КМЦ-азную или Сг-активность комплекса, микрокристаллической целлюлозы ( авицела) - авицелазную, хлопкового волокна - так называемую С - активность. Все эти активности характеризуют активность всего комплекса. Как правило, активность определяется по одной точке. Это оправдано при массовом тестировании препаратов, скрининге продуцентов. Однако при получении количественной характеристики препарата метод может приводить к значительным ошибкам. Это может значительно искажать получаемые результаты в силу диффузионных ограничений При определении активности с использованием нерастворимой целлюлозы необходимо учитывать и возможную нелинейную зависимость начальной скорости гидролиза целлюлозы от концентрации субстрата. [12]
Автор допускает возможность существования множественной атаки при действии деполимераз. Более того, он убежден, что этот механизм может играть важную роль в ферментативной деструкции нерастворимых биополимеров, где продвижение адсорбированного фермента по поверхности субстрата происходит с участием периферийных частей белковой ( гликопротеиновой) глобулы, что легко представить условно как перекатывание фермента по поверхности нерастворимого субстрата. [13]
При промышленном получении гидролаз обьино используют различные отходы, содержащие специфические субстраты. Так, в производстве пектолитиче-ских ферментов применяют пектинсодержащее сырье, например, свекловичный жом, для целлюлолитических - солому, отруби и другие целлюлозосодержащие субстраты. Но использование в промышленности сред с такими нерастворимыми субстратами не всегда оказывается технологичным, а также затрудняет направленное ведение ферментации при глубинном культивировании продуцентов. [14]
По мере исчерпания аморфных участков целлюлозы происходит постепенное дифференцирование вклада эндо - и экзоглюканаз, а также слабо и прочно адсорбирующихся ферментов. Прочно адсорбирующиеся целлюлазы, задерживаясь в местах первичного связывания, не обладают большой подвижностью по поверхности целлюлозы. Напротив, слабо адсорбирующиеся ферменты могут проводить атаки в разных областях нерастворимого субстрата. Поскольку слабо адсорбирующиеся ферменты плохо гидролизуют кристаллическую целлюлозу [44], следует ожидать, что они в основном увеличивают доступность кристаллитов за счет гидролиза аморфных областей, в то время как прочно адсорбирующиеся целлюлазы гидролизуют как аморфные, так и кристаллические участки. Это в свою очередь приводит к увеличению устойчивости субстрата к действию слабо адсорбирующихся ферментов по мере возрастания глубины гидролиза и достаточно стабильной реакционной способности во времени ( после ее некоторого начального уменьшения) при действии прочно адсорбирующихся ферментов. Отсюда становится также ясно, почему слабо адсорбирующиеся ферменты обусловливают более быстрое уменьшение СП целлюлозы, чем прочно адсорбирующиеся. Дело в том, что СП кристаллитов относительно мала ( около 150) и их гидролиз прочно адсорбирующимися ферментами не сказывается существенно на валовой СП. Слабо же адсорбирующиеся целллюлазы, атакуя преимущественно аморфные участки с высокой СП, вызывают заметную деполимеризацию субстрата. [15]