Изотахофорез
Cтраница 2
Для нейтральных и кислотных аминокислот применяют капилляры длиной 23 - 80 см, а для основных аминокислот - длиной 43 см. Разделение длится 10 - 60 мин в зависимости от длины капилляра. Для проверки степени чистоты синтетических пептидов методом изотахофореза с термическим детектированием требуется 50 мкг пептидной фракции. [16]
 |
Схема дискретного колоночного электрофореза в полиакриламидном геле. [17] |
Метод дискретного электрофореза, описанный этими авторами, или метод так называемого многофазного [48] зонного электрофореза в полиакриламидном геле, предусматривает объединение двух основных принципов электромиграции. На начальной стадии разделения происходит процесс фокусирования, сходный с изотахофорезом ( см. разд. [18]
Свободный электрофорез применяется при исследовании как клеточных компонентов биожидкостей, различных микроорганизмов, так и высокомолекулярных соединений, в первую очередь белков. Известны три основные модификации метода свободного электрофореза: 1) при микроэлектрофорезе движение частиц в поле прослеживается с помощью микроскопа; 2) при макроэлектрофорезе наблюдают за перемещением границы между растворами, содержащими и не содержащими исследуемый компонент ( метод подвижной границы); 3) зонное разделение, или изотахофорез, имеет много общего с макроэлектрофорезом. Однако для изотахофореза характерно то, что всем разделяемым компонентам сообщается одна и та же скорость миграции. [19]
Электрофорез использует различия скорости и направления движения заряженных частиц в электростатическом поле. Направление движения зависит от знака заряда, скорость - от величины заряда и размеров частицы. Изотахофорез представляет собой разновидность электрофореза, развивающуюся в течение последнего десятилетия. [20]
Свободный электрофорез применяется при исследовании как клеточных компонентов биожидкостей, различных микроорганизмов, так и высокомолекулярных соединений, в первую очередь белков. Известны три основные модификации метода свободного электрофореза: 1) при микроэлектрофорезе движение частиц в поле прослеживается с помощью микроскопа; 2) при макроэлектрофорезе наблюдают за перемещением границы между растворами, содержащими и не содержащими исследуемый компонент ( метод подвижной границы); 3) зонное разделение, или изотахофорез, имеет много общего с макроэлектрофорезом. Однако для изотахофореза характерно то, что всем разделяемым компонентам сообщается одна и та же скорость миграции. [21]
Очень хорошее разделение получается с помощью новых стабилизованных источников питания [44], дающих максимальный градиент напряжения, согласующийся с максимально допустимой скоростью нагревания. Эти источники позволяют максимально использовать аппарат без риска перегрева носителя. Электрические схемы источников тока для капиллярного изотахофореза изображены на рис. 12.19 и 12.20. Для обесцвечивания гелей используется тот же источник питания, что и для электрофореза, а для быстрого обесцвечивания напряжение прикладывают перпендикулярно болеее длинной оси геля с помощью источника нестабилизованного постоянного тока около 0 5 А и напряжением до 50 В. [22]
 |
Расположение зон на различных стадиях диск-электрофореза. [23] |
На стадии расфокусирования зоны переходят из концентрирующего геля в разделяющий. В разделяющем геле компоненты подвергаются просеиванию, и, следовательно, их подвижность уменьшается из-за более высокой концентрации акриламида. Это резко нарушает стационарные условия, которые определяют существование стопки зон при изотахофорезе. По мере того как фаза бета мигрирует в разделяющий гель, создается новая фаза - ламбда. По мере перемещения движущейся границы ( ламбда / гамма) компонент 1 фазы дзета вступает в разделяющий гель, его подвижность становится больше подвижности белков, и компонент / начинает двигаться впереди них. Таким образом, появляется новая фаза пи и новая движущаяся граница ( пи / ламбда), через которую проходят все зоны белков. Они разделяются в соответствии с их индивидуальными скоростями, определяемыми величиной рН фазы пи, проводимостью и величиной приложенного напряжения. [24]
После разделения зон методом ИТФ в стационарном состоянии яи длина зон, ни кои цен грация в зонах не меняются. Если, наряду с этим, существует уверенность, что зоны движутся с постоянной скоростью, имеющееся количество вещества можно оценить, исходя из длины зоны. Установлено, что при постоянной скорости миграции зон через детектор в единицу времени ( изотахофорез при постоянном токе) проходит одинаковое число зарядов. В этом случае напряжение в капилляре постепенно-увеличивается пропорционально миграции зоны, а электролит, содержащий ведущий ион, который вначале заполняет все капиллярное пространство, замещается на мигрирующие зоны образца. После этого ионы замыкающего электролита движутся-с максимальным электрическим сопротивлением, и при этом выделяется максимальное количество джоулева тепла. В ходе этого процесса электрическое сопротивление является величиной, качественно характеризующей ионы электролита данного состава. [25]
В 1937 г. Тизелиус [33] разработал такую методику свободного электрофоретического разделения веществ, прежде всего белков, которая стала впоследствии классической. Он не только удачно смонтировал электрофорети-ческие ячейки, но и обеспечил регулирование в них температуры, а также ( что еще важнее) использовал соответствующую оптическую систему для наблюдения за движением границ между разделяемыми веществами, что позволило непосредственно следить за ходом процесса разделения отдельных компонентов смеси и фотографировать его В дальнейшем электрофоретичес-кий метод совершенствовался многими исследователями: они использовали более простые приспособления, главным образом с носителями, стабилизующими разделенные электрофорезом зоны. В настоящее время разрабатывается еще один вариант электрофоретического разделения, основанный на принципе подвижной ионной границы - метод изотахофореза. Основы этого метода были изложены в 1923 г. Кендаллом и Криттенденом [16], но только публикация статей Константинова и Ошурковой в 1963 г. [17] и Мартина и Эверертса в 1970 г. [ 20а ] открыла путь более широкому его применению. [26]
Наряду с КЗЭ, при котором удается осуществить разделение только за счет разницы в подвижности, и который в настоящее время представляет собой наиболее распространенный метод, выделяют также капиллярный гель электрофорез ( КГЭ) с капилляром, заполненным гелем. При этом на электрофоретическую миграцию молекул оказывает влияние матрица геля, и поэтому достигается селективное разделение молекул по размерам. В данном случае к буферу добавляется детергент, и нейтральные молекулы распределяются между буфером и мицеллами в соответствии с их гидрофобностью. Разделение основано на подвижности мицелл, заряженных в большинстве случаев отрицательно. Поскольку в основе разделения лежит процесс распределения, можно с полным основанием говорить о хроматографическом методе. При изоэлектрической фокусировке ( ИЭФ) происходит разделение в градиенте рН, формируемом добавлением амфолита к буферу в электрическом поле. Небольшое распространение получила пока электрохроматография ( ЭХ), при которой применяется стационарная среда ВЭЖХ, а течение эдюента и перенос пробы происходит только за счет электроосмотического потока. В качестве самой старой капиллярной техники следует упомянуть изотахофорез ( ИТФ), который в настоящее время вновь приобрел значение для концентрирования проб в КЭ. [27]
При контакте разделенных антигенов и антител образуются характерные дуги осаждения. Отличающийся высокой чувствительностью иммуноэлектрофорез был усовершенствован путем введения радиоактивной метки в антигены, и в настоящее время радиоиммуноэлектрофорез [110] является одним из самых чувствительных аналитических методов анализа биополимеров. В методе взлетающей ракеты ( fused-rocket) [57, 94] иммунопреципитация происходит в процессе электрофорети-ческой миграции в блоке геля. При разделении этим методом антитела равномерно диффундируют в гель и не перемещаются во время электрофореза. Этот быстрый метод пригоден для избирательного количественного анализа большого числа фракций. Полиакриламидный гель наименее химически активен. Его слабое сродство к красителям позволяет осуществлять быстрое обнаружение биополимеров, главным образом белков, нуклеиновых кислот и продуктов их деградации, с помощью окрашивания. Прозрачный полиакриламидный гель обладает хорошими механическими свойствами, допускающими изменение концентрации полиакрилампда в самых широких пределах. Электроосмотические эффекты в этом геле очень малы. Условия аналитических и препаративных разделений на полиакриламидном геле путем зонного электрофореза в гомогенных и дискретных системах буферных растворов [48, 77], а также изотахофореза и изо-электрического фракционирования хорошо изучены. [28]
Страницы: 1 2