Cтраница 2
Мп / х - продукты деструкции субстрата с уменьшенной СП, М, - оли-госахариды с СП больше 2, MI - целобиоза, М - глюкоза. Если субстрат нерастворим, то гидролитической стадии предшествует стадия адсорбции ферментов. Однако роль таких важных параметров, как изменение реакционной способности субстрата под действием ферментов, относительное содержание компонентов целлюлазного комплекса, концентрация ферментного препарата и субстрата, как правило, не учитывается. [16]
В качестве сорбентов - носителей ферментов часто используют гель гидроокиси алюминия или фосфата кальция, диатомит, модифицированный крахмал, бентониты, кизельгуры и др. Сорбцию ферментов осуществляют либо в колонках путем пропускания раствора фермента с определенной скоростью через слой ионитов, либо в реакторах, в которых сорбент определенное время перемешивают с раствором фермента. Полученный продукт затем используют как иммобилизованный ферментный препарат. Адсорбция фермента к носителю не обеспечивает их длительную стабилизацию. Более длительную стабилизацию обеспечивает ионообменное связывание фермента, например на модифицированных ионообменных целлюлозах. [17]
Выделение и очистка ферментов представляют собой трудную задачу вследствие крайне низкого содержания ферментов в растительном и животном материале, а также их нестойкости и коллоидной природы. Среди известных методов получения в чистом виде ферментов большое значение имеет метод адсорбции. При соответственно подобранном рН адсорбция ферментов может происходить на трикальцийфосфате, гидроокиси алюминия, каолине и некоторых других адсорбентах. Адсорбированный фермент вытесняется буферным раствором. Адсорбция ферментов может проводиться в статических условиях, но часто оказывается удобным применять адсорбент в виде хроматографической колонки. [18]
Определение кинетических констант, таких, как Км и Vmax, для липолити-ческих ферментов представляет значительные трудности. Необходимо делать ряд допущений, связанных со спецификой данных реакций. Например, при оценке Км приходится учитывать адсорбцию фермента в суперсубстрат, в который включен субстрат на границе раздела фаз. [19]
Адсорбционные свойства свежеприготовленных алюминиевого и кальций-фосфатного гелей изменяются при хранении. Поэтому в литературе встречаются рекомендации использовать для работы постаревшие ( в течение нескольких недель или месяцев) гели. Однако каждый раз требуемое количество геля, необходимое для адсорбции фермента или балластных белков, приходится подбирать экспериментально. Обычно оно не соответствует количествам, использованным в предыдущем выделении или указанным в методике. [20]
В течение многих лет энзимы и родственные им белковые вещества очищались добавлением сорбента к раствору, что основано на неодинаковом отношении компонентов смеси к различным сорбентам. Сорбенты не захватывают посторонних веществ, находящихся в смеси, оставляя их в растворе. Подбирая подходящий растворитель, фермент можно избирательно отделять от сорбента. Адсорбция фермента зависит от ряда условий: природы сорбента, способа его приготовления, чистоты раствора, содержащего адсорбируемый фермент, объема жидкости, природы растворителя, рН среды, присутствия электролитов и пр. [21]
В настоящее время известны способы, позволяющие иммобилизовать ферменты на носители, обладающие электронной проводимостью. Одним из наиболее перспективных материалов для создания электрокатализаторов на основе иммобилизованных ферментов является углерод. Для получения электродов с большой поверхностью перспективна высокодисперсная сажа, на которую возможна адсорбционная и химическая иммобилизация ферментов. В ряде случаев адсорбция фермента на поверхности сажи практически необратима. С использованием различных связующих из сажи может быть сформован высокопористый электрод, обладающий развитой поверхностью. [22]
Выделение и очистка ферментов представляют собой трудную задачу вследствие крайне низкого содержания ферментов в растительном и животном материале, а также их нестойкости и коллоидной природы. Среди известных методов получения в чистом виде ферментов большое значение имеет метод адсорбции. При соответственно подобранном рН адсорбция ферментов может происходить на трикальцийфосфате, гидроокиси алюминия, каолине и некоторых других адсорбентах. Адсорбированный фермент вытесняется буферным раствором. Адсорбция ферментов может проводиться в статических условиях, но часто оказывается удобным применять адсорбент в виде хроматографической колонки. [23]
Их подвижность указывала на то, что это, по всей вероятности, белок, близкий к глобулинам. Она была неустойчива к нагреванию, инактивировалась следами тяжелых металлбЪ Лри перекристаллизации активность, соотнесенная с содержанием азота в препарате, оставалась неизменной. Самнер сделал вывод о том, что уреаза является одноком-понентным ферментом белковой природы. В качестве дополнительного доказательства, должного опровергнуть традиционные возражения, связанные с допущением адсорбции чрезвычайно активных истинных ферментов на белках, Самнер привел следующий факт. Содержащийся в тех же бобах другой белок, конканаваллин В, не обнаруживал при выделении никакой ферментативной активности, что было бы неизбежно при правильности гипотезы о загрязнении препаратов. [24]
Так как препараты фосфоцеллюлозы отличаются между собой, целесообразно предварительно установить количество ионообменника, необходимое для связывания фермента. Берут ( в расчете на сухой вес) 5 г фосфоцеллюлозы, уравновешенной буфером А, и добавляют определенную порцию раствора белка. В элюате определяют активность глюкозофосфатизомеразы. Последующие порции белка добавляют до полного насыщения ионообменника ферментом. На основе этих данных рассчитывают количество фосфоцеллюлозы, требующееся для связывания всего фермента. Суспензию перемешивают 30 - 40 мин, после чего в элюате определяют ферментативную активность, чтобы убедиться в полноте адсорбции фермента. [25]
Комплексный амилолитический ферментный препарат полу - i чают путем выращивания плесневых грибов на твердой питательной среде с последующей сушкой и измельчением полученной массы. Более активный препарат фермента получают путем экстракции такого грибного солода с последующим выпариванием и сушкой. Для осаждения фермента часто используют и сульфат аммония. Предварительно культуральную жидкость выпаривают при температуре 40 С до 40 % - ного содержания сухих веществ. В Японии для пищевых нужд используют технический препарат амилазы, полученный адсорбцией фермента из культуральной жидкости особо обработанным крахмалом. Затем амилазу вместе с крахмалом лиофилизируют. [26]
При изучении реакций и процессов, происходящих в живой клетке, не всегда можно использовать результаты исследований, полученные при работе с очищенными ферментами. Длительное время оставалось неясным, каким образом в живой клетке находятся в близком соседстве, не приходя во взаимодействие, ферменты и вещества, на которые они могут действовать. Очевидно, в клетке имеется какое-то пространственное разделение ферментов и веществ, поэтому они не взаимодействуют друг с другом. По его мнению, ферменты в живых клетках могут адсорбироваться на поверхностях макрогетерогенных систем, например на белковых веществах протоплазмы клетки, теряя при этом свою гидролитическую способность. Но она может возвратиться в том случае, если ферменты опять перейдут в раствор. Подтверждением правильности этой теории является наличие большого фактического материала. Можно привести следующий пример: А. И. Опарин и А. Л. Курсанов показали, что при адсорбции ферментов на дубильных веществах теряется их гидролитическая активность, но это связано не с изменением самих ферментов, а только лишь с переходом их из раствора в осадок. Если такие ферменты перевести опять в раствор, то активность их восстанавливается. [27]