Cтраница 2
В монографии [2] приведены примеры ТСХ соединений различных классов, содержащих атом серы в молекуле ( главным образом биологически активных): сульфолипидов, витамина Вь биотина, суль-фонамидов, пенициллинов, фенилтиогидантоинов и серусодержащих инсектицидов. [16]
Метод Эдмана последовательной деградации пептидов и белков основан на реакции фенилизотиоцианата с концевой аминогруппой в щелочной среде, которая приводит сначала к образованию тиомочевинной метки концевой аминокислоты, последняя при действии CF3COOH отщепляется, в конечном счете, в виде замещенного фенилтиогидантоина, после чего полипептидная цепь белка укорачивается на один аминокислотный остаток. [17]
Однако методу свойствен и ряд недостатков. Условия циклизации и отщепления фенилтиогидантоинов неодинаковы для различных белков, и их приходится подбирать для каждого конкретного случая. [18]
Разделение производных аминокислот очень важно при определении строения пептидов. Для этой цели используют реакции белков и пептидов с 2 4-динитрофторбензолом, 1-диметиламино-нафталин - 5-сульфонилхлоридом или фенилизоцианатом с последующим распадом до динитрофениламинокислот, 1-диметилами-нонафталинсульфониламинокислот ( ДАНС - или ДНС-аминокис-лоты) и фенилтиогидантоинов соответственно. Методика приготовления этих производных описана в литературе ( ДНФ [94-97], ДАНС [98-101], ФТГ [102-106]) и здесь не рассматривается. Росмус и Дейл [ 106а - 106в ] обобщили работы по методам идентификации N-концевых аминокислот в пептидах и белках. [19]
Теоретически этот процесс можно проводить многократно до полного определения последовательности аминокислот. Однако многократное отщепление концевых аминокислотных остатков приводит к усиливающемуся повреждению оставшейся пептидной цепи, и обычно можно отделять максимум шесть или семь остатков. Для определения последовательности аминокислот необходим метод идентификации фенилтиогидантоинов, получаемых в результате ступенчатой деградации пептидов. Идентификация и определение фенилтиогидантоинов иногда трудно осуществимы, и следует использовать метод отщепления, примененный, например, при определении структуры рибонуклеазы. После удаления N-концевой аминокислоты в виде фенилтиогидантоина оставшийся пептид гидроли-зуют и анализируют. Последовательность аминокислот в этом пептиде определяют по аминокислотным остаткам, сохраняющимся в нем после каждого отщепления N-концевой аминокислоты. [20]
При действии фенилизотиоцианата ( фенилгорчичного масла) на свободные аминогруппы пептидов и белков образуются соответствующие производные тиомочевины. Обработка их соляной кислотой приводит к отщеплению N-концевой аминокислоты в виде 2-фениламинотиазолинонового производного, легко изомеризующегося в фенилтиогидантоин, который может быть выделен и идентифицирован. Остаток молекулы пептида или белка может быть снова подвергнут тем же превращениям, в результате чего отщепляется в виде фенилтиогидантоина следующая аминокислота. Так как реакция протекает почти количественно, этим способом удается отщепить один за другим до 10 остатков аминокислот и определить тем самым их последовательность. [21]
Теоретически этот процесс можно проводить многократно до полного определения последовательности аминокислот. Однако многократное отщепление концевых аминокислотных остатков приводит к усиливающемуся повреждению оставшейся пептидной цепи, и обычно можно отделять максимум шесть или семь остатков. Для определения последовательности аминокислот необходим метод идентификации фенилтиогидантоинов, получаемых в результате ступенчатой деградации пептидов. Идентификация и определение фенилтиогидантоинов иногда трудно осуществимы, и следует использовать метод отщепления, примененный, например, при определении структуры рибонуклеазы. После удаления N-концевой аминокислоты в виде фенилтиогидантоина оставшийся пептид гидроли-зуют и анализируют. Последовательность аминокислот в этом пептиде определяют по аминокислотным остаткам, сохраняющимся в нем после каждого отщепления N-концевой аминокислоты. [22]
Выход на этой стадии может существенно снижаться вследствие побочных реакций. Такими реакциями являются окислительное десуль-фированне ФТК-группы пептида под действием кислорода воздуха, блокирование сх-аминогруппы пептида за счет образования оснований Шиффа со следовыми количествами альдегидов, присутствующих в реагентах и растворителях. Поэтому все стадии деградации пептида по методу Эдмана проводятся в атмосфере инертного газа, а употребляемые реагенты предварительно тщательно очищаются. В щелочных условиях ФИТЦ гидролизуется с образованием дифенилтиомочевнны и анилина. Побочные продукты затрудняют идентификацию фенилтиогидантоинов аминокислот, поэтому после стадии присоединения производится экстракция реакционной смеси бензолом для удаления остатков ФИТЦ и побочных продуктов. [23]
Теоретически этот процесс можно проводить многократно до полного определения последовательности аминокислот. Однако многократное отщепление концевых аминокислотных остатков приводит к усиливающемуся повреждению оставшейся пептидной цепи, и обычно можно отделять максимум шесть или семь остатков. Для определения последовательности аминокислот необходим метод идентификации фенилтиогидантоинов, получаемых в результате ступенчатой деградации пептидов. Идентификация и определение фенилтиогидантоинов иногда трудно осуществимы, и следует использовать метод отщепления, примененный, например, при определении структуры рибонуклеазы. После удаления N-концевой аминокислоты в виде фенилтиогидантоина оставшийся пептид гидроли-зуют и анализируют. Последовательность аминокислот в этом пептиде определяют по аминокислотным остаткам, сохраняющимся в нем после каждого отщепления N-концевой аминокислоты. [24]
После сушки каждую полоску увлажняют 50 - 70 [ хд свежеприготовленного 20 % - ного раствора фенилизотиоцианата в диоксане, не содержащем перекиси. Затем полоски промывают несколько раз бензолом, слегка встряхивая их, причем каждый раз берут новую порцию бензола. Далее полоски промывают равными частями абсолютного этанола и эфира, не содержащего перекиси. Промывание продолжают до тех пор, пока оптическая плотность при 270 м 1 4 мл жидкости после встряхивания в течение 2 - 3 час будет ниже 0 025; этого обычно достигают через 24 час. Эксикатор эвакуируют до остаточного давления 100 мм рт. ст. Через 4 - 16 час ( в зависимости от характера белка) бумагу проветривают и отщепившийся фенилтиогидантоин экстрагируют смесью этанол - эфир. N-концевая группа аминокислоты определяется либо непосредственно хроматографированием фенилтиогидантоина, либо в виде свободной аминокислоты после гидролиза фенилтиогидантоина. После экстракции смесью этанол - эфир полоски считаются готовыми для дальнейшей стадии разложения. [25]
Реакция аминогруппы с фенилизотиоцианатом нашла широкое применение для определения N-концевых аминокислот белка или пептидов. Впервые этот метод был предложен в 1950 г. Эдманом. При взаимодействии фенилизотиоциана-та с а-аминогруппами N-концевых аминокислот белка образуется фенилтиокарбамильное производное белка. При обработке фенилтиокарбамильного производного белка кислотой происходят циклизация и отщепление N-концевых остатков в виде фенилтиогидантоинов. Последние могут быть хроматографически разделены и идентифицированы; можно расщепить их и до свободных аминокислот и определить последние. Остающийся после отщепления фенилтиогидантоина белок содержит на одну аминокислоту меньше, чем исходный. [26]
После сушки каждую полоску увлажняют 50 - 70 [ хд свежеприготовленного 20 % - ного раствора фенилизотиоцианата в диоксане, не содержащем перекиси. Затем полоски промывают несколько раз бензолом, слегка встряхивая их, причем каждый раз берут новую порцию бензола. Далее полоски промывают равными частями абсолютного этанола и эфира, не содержащего перекиси. Промывание продолжают до тех пор, пока оптическая плотность при 270 м 1 4 мл жидкости после встряхивания в течение 2 - 3 час будет ниже 0 025; этого обычно достигают через 24 час. Эксикатор эвакуируют до остаточного давления 100 мм рт. ст. Через 4 - 16 час ( в зависимости от характера белка) бумагу проветривают и отщепившийся фенилтиогидантоин экстрагируют смесью этанол - эфир. N-концевая группа аминокислоты определяется либо непосредственно хроматографированием фенилтиогидантоина, либо в виде свободной аминокислоты после гидролиза фенилтиогидантоина. После экстракции смесью этанол - эфир полоски считаются готовыми для дальнейшей стадии разложения. [27]
Реакция аминогруппы с фенилизотиоцианатом нашла широкое применение для определения N-концевых аминокислот белка или пептидов. Впервые этот метод был предложен в 1950 г. Эдманом. При взаимодействии фенилизотиоциана-та с а-аминогруппами N-концевых аминокислот белка образуется фенилтиокарбамильное производное белка. При обработке фенилтиокарбамильного производного белка кислотой происходят циклизация и отщепление N-концевых остатков в виде фенилтиогидантоинов. Последние могут быть хроматографически разделены и идентифицированы; можно расщепить их и до свободных аминокислот и определить последние. Остающийся после отщепления фенилтиогидантоина белок содержит на одну аминокислоту меньше, чем исходный. [28]