Нитроцеллюлозный фильтр

Cтраница 2

Этот метод заключается в том, что после лизиса клеток хозяина ДНК различных клонов, фиксированную например, на нитроцеллюлозном фильтре, после удаления сопутствующих белков подвергают термообработке, в ходе которой происходит отжиг - раскручивание двунитевых молекул и образование клубков однонитевых ДНК. [16]

Нуклеопротеид-целитная хроматографи я ( текст [ Лихтенштейн и др., 1979 ]. [17]

Ранее при рассмотрении метода электрофореза [ Остерман, 19811 и описании различных вариантов элюции нуклеиновых кислот из гелей уже упоминался тот факт, что нитроцеллюлоза ( в частности, нитроцеллюлозные фильтры) сорбирует однонитевые молекулы денатурированной ДНК, но не сорбирует нативную, двунитевую ДНК. [18]

ДНК-зонды, приготовленные из рестрик-ционных фрагментов таких плазмид. Колонии эшерихий выращивают на поверхности нитроцеллюлозных фильтров, наложенных на поверхность питательного агара, лизируют их и с помощью ДНК-зондов определяют в лизатах нуклеотидные последовательности, кодирующие у патогенных эшерихий синтез факторов адгезии, инвазии и / или соответствующих токсинов ( см. подразд. [19]

В специализированных лабораториях вирулентность культур определяют на экспериментальных животных и методами генодиагностики. Для этого применяют соответствующие ДНК-зонды ( ДНК-ДНК гибридизация на нитроцеллюлозных фильтрах) или ПЦР со специфическими прайм ерами. [20]

Для выявления рекомбинантных клонов, синтезирующих экзоглюканазу, использовали иммунный скрининг, позволяющий идентифицировать белок-мишень с помощью специфичных к нему антител; секреция белка при этом необязательна. Рекомбинантные клетки лизи-ровали in situ ( парами хлороформа), перенесли цитоплазматические белки на найлоновый или нитроцеллюлозный фильтр и провели иммунологический тест. Использованный при этом метод реплик позволил сохранить жизнеспособные клетки для дальнейших исследований. [21]

При сборе вирусных частиц из природных проб необходимо применять специальные методы их концентрирования. Вирусы можно сконцентрировать из водных образцов при неоднократной ад-сорбции / элюции подкисленных проб при пропускании их через эпоксидные, фиберглассовые или нитроцеллюлозные фильтры. Сорбированные частицы затем элюируют щелочными растворами. Процедуру можно неоднократно повторять, тысячекратно концентрируя вирусные частицы, например из морской воды или проб осадков. [22]

Гибридные комплексы могут быть получены между двумя видами ДНК или между ДНК и РНК. Их образование может быть обнаружено, а количество их оценено с помощью равновесного ультрацентрифугирования в градиенте плотности или по способности двухцепочечных комплексов задерживаться нитроцеллюлозными фильтрами. Количество задержанного на колонке полинуклеотида легко определить. [23]

На этом основании можно предположить, что частицы асфальтенов меньше, когда присадка оказывается более эффективным солюбилизирующим агентом. Поскольку меньшему размеру частиц в свою очередь соответствует большая стабильность коллоидной системы, вышеуказанное предположение можно проверить, сравнив данные, полученные при фильтрации образцов изооктана с присадками и асфальтенами через нитроцеллюлозные фильтры. [24]

Для определения содержания минеральной части в загрязнениях используют и другие методы. Например, по ГОСТ 6370 - 59 пробу топлива фильтруют через беззольный бумажный фильтр. Этот метод намного уступает методам, основанным на применении нитроцеллюлозных фильтров, так как бумажные фильтры гигроскопичны и поэтому в зависимости от содержания воды может изменяться сечение пор. Кроме того, на поверхности бумажных фильтров в большей степени могут адсорбироваться поверхностно-активные вещества. [25]

Если вставка содержит геиы, способные к экспрессии в новом хозяине, рекомбинантные клоны могут быть идентифицированы по синтезируемому ими продукту. Однако чаще приходится идентифицировать непосредственно нуклеотндную вставку, для чего используют методы гибридизации. После этого приготавливаются так называемые реплики - к фильтру с исходными колониями прижимается свежий нитроцеллюлозный фильтр, который затем переносится на чашку Петри с плотной питательной средой, где на нем образуются колонии, идентичные первым. [26]

Этот метод, получивший название блоттинг по Саузерну, предшествовал описанному в разд. РНК и заключается в том, что фрагменты ДНК диффундируют из геля к поверхности нитроцеллюлозного фильтра и при нагревании последнего ковалентно связываются с ним. Фрагменты ДНК могут быть также перенесены на диазо-бензилоксиметилцеллюлозу [111, 112], к преимуществам которой перед нитроцеллюлозой относятся возможность повторного использования фильтров и более высокая эффективность связывания небольших фрагментов ДНК. На рис. 10.9 показан пример использования электрофореза в ага-розном геле для разделения фрагментов ДНК и их последующего анализа с помощью метода молекулярной гибридизации. [27]

Первые успешные опыты были проведены Баутцем и Холлом [2]; авторы использовали колонки с нитроцеллюлозой, на которой была закреплена глюкозилированная ДИК. Бриттен [1] фиксировал ДНК, облучая ее УФ-светом в смеси с синтетическими цоли-мерами; эту смесь затем помещали в колонку для гибридизации. Наиболее современный удобный метод закрепления ДНК основан на наблюдении Найгарда и Холла [6, 7], которые обнаружили, что нитроцеллюлозные фильтры хорошо сорбируют денатурированную ДНК, тогда как РНК на них не сорбируется. [28]

Приготовленные указанными способами ультрафильтры могут быть использованы и для фильтрования растворов в некоторых органических растворителях. Для этого воду из фильтра вытесняют спиртом, а затем бензолом или другим подходящим растворителем. Следует помнить, что фильтрами из нитроцеллюлозы нельзя пользоваться для фильтрования растворов в эфире, ацетоне, ледяной уксусной кислоте, уксусноэтиловом эфире, так как эти растворители растворяют нитроцеллюлозу или вызывают ее набухание. Нитроцеллюлозные фильтры устойчивы по отношению к кислотам, разбавленным щелочам, а также к бензолу, толуолу, четыреххло-ристому углероду, хлороформу, сероуглероду. [29]

Приготовленные указанными способами ультрафильтры могут быть использованы и для фильтрования растворов в некоторых органических растворителях. Для этого воду из фильтра вытесняют спиртом, а затем бензолом или другим подходящим растворителем. Следует помнить, что фильтрами из нитроцеллюлозы нельзя пользоваться для фильтрования растворов в эфире, ацетоне, ледяной уксусной кислоте, уксусноэтиловом эфире, так как эти растворители растворяют нитроцеллюлозу или вызывают ее набухание. Нитроцеллюлозные фильтры устойчивы по отношению к кислотам, разбавленным щелочам, а также к бензолу, толуолу, четыреххлористому углероду, хлороформу, сероуглероду. [30]

Страницы: 1 2 3