Нитроцеллюлозный фильтр
Cтраница 3
 |
Плавление ДНК. [31] |
В молекулярной биологии широко используется способность денатурированных ДНК ренатурировать с восстановлением исходной двуспиральной структуры. Для этого денатурированную ДНК ( если изучается гибридизация двух различных нуклеиновых кислот, то одна из них несет радиоактивную метку) помещают в условия, оптимальные для образования двойных спиралей ( ионная сила раствора - около 0 2; температура - на 10 - 20 СС ниже Тт нативной ДНК) - В случае полностью комплементарных цепей ДНК со временем они целиком превратятся в дву-спиральные молекулы. Если в смеси присутствуют как комплементарные, так и некомплементарные цепи ДНК, то после ренатурации первых тем или иным способом определяют долю двуспиральных молекул. ДНК одного типа закрепляются на нитроцеллюлозных фильтрах, которые затем помещают в раствор ДНК ( или РНК) другого типа. После образования двуспиральных комплексов на фильтрах они легко могут быть отмыты от несвязавшейся ДНК - Этот же подход используется при выявлении цепей ДНК ( или РНК), комплементарных другим ДНК ( или РНК), после разделения их электрофорезом в гелях. [32]
 |
Синтетический ген проинсулина человека. [33] |
Смесь фагов выделяется н высевается на чашки Петри таким образом, чтобы каждый фаг дал отдельную колонию. Для отличия диких колоний от мутантных используются разнообразные методы - биологические, если мутация меняет биологическую функцию, рестриктный анализ при нарушении участков расщепления рестриктазами илн гибридизация с олигонуклеотидами, использовавшимися для введения мутаций. Последний метод основан на том, что неполностью комплементарные олигонуклеотнды образуют с ДНК значительно менее стабильные комплексы, чем комплементарные олигонуклеотнды и гибридизующиеся при более высоких температурах. Поэтому гибридизация с ДНК фагов, фиксированных на нитроцеллюлозных фильтрах, при низких температурах приводит к образованию комплексов как с мутантными, так и с дикими ДНК, а при высоких - только с мутантными, которым синтетический олигонуклеотид полностью комплементарен. [34]
 |
Плавление ДНК. [35] |
В молекулярной биологии широко используется способность денатурированных ДНК ренатурировать с восстановлением исходной двуспиральной структуры. В случае полностью комплементарных цепей ДНК со временем они целиком превратятся в дву-спиральные молекулы. Если в смеси присутствуют как комплементарные, так и некомплементарные цепи ДНК, то после ренатурации первых тем или иным способом определяют долю двуспиральных молекул. В настоящее время широко распространены методы, когда денатурированные молекулы ДНК одного типа закрепляются на нитроцеллюлозных фильтрах, которые затем помещают в раствор ДНК ( или РНК) другого типа. После образования двуспиральных комплексов на фильтрах они легко могут быть отмыты от несвязавшейся ДНК. Этот же подход используется при выявлении цепей ДНК ( или РНК), комплементарных другим ДНК ( или РНК), после разделения их электрофорезом в гелях. [36]
 |
Плавление ДНК. [37] |
В молекулярной биологии широко используется способность денатурированных ДНК ренатурировать с восстановлением исходной двуспиральной структуры. Для этого денатурированную ДНК ( если изучается гибридизация двух различных нуклеиновых кислот, то одна из них несет радиоактивную метку) помещают в условия, оптимальные для образования двойных спиралей ( ионная сила раствора - около 0 2; температура - на 10 - 20 СС ниже Тт нативной ДНК) - В случае полностью комплементарных цепей ДНК со временем они целиком превратятся в дву-спиральные молекулы. Если в смеси присутствуют как комплементарные, так и некомплементарные цепи ДНК, то после ренатурации первых тем или иным способом определяют долю двуспиральных молекул. В настоящее время широко распространены методы, когда денатурированные молекулы ДНК одного типа закрепляются на нитроцеллюлозных фильтрах, которые затем помещают в раствор ДНК ( или РНК) другого типа. После образования двуспиральных комплексов на фильтрах они легко могут быть отмыты от несвязавшейся ДНК - Этот же подход используется при выявлении цепей ДНК ( или РНК), комплементарных другим ДНК ( или РНК), после разделения их электрофорезом в гелях. [38]
В байку на 500 CMS с хорошо пришлифованной пробкой ( полную герметичность банки следует предварительно проверить при помощи эфира), находящуюся в смеси льда с солью, вводят 188 см хорошо охлажденной дымящей соляной кислоты, в которой растворяют 25 г чистого метилового эфира N-метилантраниловой кислоты. Вносят несколько больших стеклянных шариков и прибавляют 15 г хорошо охлажденного крупнокристаллического азотистокислого натрия. Герметично закрытую банку механически взбалтывают при охлаждении льдом в течение 3 час. Смесь оставляют стоять на 1 - 2 дня при комнатной температуре, после чего выделившуюся в виде желтых шелковистых игл солянокислую соль отсасывают через кислотоупорный нитроцеллюлозный фильтр, промывают очень небольшим количеством концентрированной соляной кислоты и затем переносят в большую ступку, где соль разлагают, растирая ее с 1 л воды. Таким образом, получают 11 г 5-питрозоэфира в виде игл чисто зеленого цвета. При прибавлении к маточнику разбавленного раствора соды выпадает дополнительное количество продукта. К первому фильтрату, содержащему хлористый нитрюзил, также прибавляют раствор соды или разбавленный раствор аммиака. Выход полученного в общей сложности продукта составляет 87 % от теории. После перекристаллизации из большого объема кипящей воды или, лучше, из лигроина эфир 5-нитрозомстилаитрапиловой кислоты выделяется в светлозеленых красивых иглах с темп. [39]
При гомологии трансгена с каким-либо участком генома мыши используют блот-гибризацию, если же гомология незначительна или она отсутствует совсем, то ограничиваются дот-блот - или слот-блот-анализом ( от анг. В первом случае, когда трансген идентичен эндогенному гену, он все равно окружен другими нуклеотидными последовательностями. Поэтому, используя ре-стриктазы, удается доказать локализацию трансгена в иных ре-стрикционных фрагментах. Во втором случае, когда трансген негомологичен геному мыши, то он ограничен другими сайтами рестрикции, и здесь удобен дот-блот - или слот-блот-анализ в качестве экпсресс-метода. Фрагменты анализируемой геномной ДНК на нитроцеллюлозных фильтрах выявляют при экспозиции с рентгеновской пленкой. [40]
Страницы: 1 2 3