Cтраница 3
Флуорохромирование проводят либо прижизненное, либо на фиксированных препаратах. Прижизненное флуорохромирование в свою очередь может быть осуществлено или на целом животном или растительном организме ( путем инъекции или введения с пищей), или на отдельных тканях и клетках. Прижизненное флуорохромирование особенно полезно при исследованиях функционального состояния и физико-химической характеристики органов, тканей и клеток. [31]
Этот краситель дает яркую флуоресценцию всех микроорганизмов природной воды, разнообразных по видовому составу, хорошо дифференцирует бактериальные клетки от посторонних частичек. Лучшие результаты получены при флуорохромировании бактерий не в объеме пробы, а непосредственно на мембранном фильтре при помещении его бактериями вверх на поверхность раствора флуорохрома. Время флуорохромирования 15 мин при температуре 20 С. Необходимым условием является высушивание мембранных фильтров до и после флуорохромирования. Разработан ускоренный вариант метода. В этом случае для флуорохромирования используют горячий ( 70 С) раствор лактата этакридина, время экспозиции сокращают до 2 мин, а мембранные фильтры высушивают сухим жаром, что сокращает продолжительность операции в 10 раз. [32]
В наших исследованиях разработано получение нелюминесцирующих мембранных фильтров. За рубежом такие фильтры выпускает промышленность, что значительно упрощает метод и делает его пригодным для практики. Применение прямого флуорохромирования, по мнению Е. Н. Левиной ( 1968), придает люминесцентному методу значительную чувствительность, обеспечивает быстроту и простоту анализа. [33]
Быстрое и специфическое обнаружение каких-либо веществ или организмов с помощью флуоресцирующих метчиков часто выполняют с помощью люминесцентного микроскопа. Для прямого флуорохромирования клеток используют акридиновый оранжевый, риванол, профлавин ( см. гл. [34]
Крупные частицы состоят из клеток фитопланктона, обрывков тканей более крупных организмов, ярко окрашенных, бледно-розовых, бесцветных, зеленоватых. Составляя всего 3 % от общего количества частиц, по своим размерам и биомассе они во много раз превосходят микробные клетки. При использовании флуорохромирования микроорганизмов в объеме пробы свечение этих частиц вызовет большую ошибку, поэтому в таких случаях необходимо предусматривать освобождение пробы от крупных частиц перед определением. В этих случаях неизбежны потери адсорбированных микроорганизмов и соответствующая ошибка подсчета. [35]
Этот краситель дает яркую флуоресценцию всех микроорганизмов природной воды, разнообразных по видовому составу, хорошо дифференцирует бактериальные клетки от посторонних частичек. Лучшие результаты получены при флуорохромировании бактерий не в объеме пробы, а непосредственно на мембранном фильтре при помещении его бактериями вверх на поверхность раствора флуорохрома. Время флуорохромирования 15 мин при температуре 20 С. Необходимым условием является высушивание мембранных фильтров до и после флуорохромирования. Разработан ускоренный вариант метода. В этом случае для флуорохромирования используют горячий ( 7б С) раствор лактата этакридина, время экспозиции сокращают до 2 мин, а мембранные фильтры высушивают сухим жаром, что сокращает продолжительность операции в 10 раз. [36]
При флуорохромироваиии жиров и липоидов различными флуорохромами также могут быть выявлены их особенности по специфическому характеру люминесценции. Перспективным здесь следует считать комбинированное использование различных жирорастворителей с флуорохромами. Особый интерес представляют возможности, открываемые при прижизненном флуорохромировании. [37]
Рассматриваемый метод ограничен тем, что далеко не все объекты исследования обладают собственной люминесценцией в видимой области, а некоторые дают однотонную малоконтрастную картину. В таких случаях приходится прибегать, как и в обычной микроскопии, к искусственному окрашиванию препаратов флуоресцирующими красителями. Такие красители называют флу-орохромами, а окрашивание ими - флуорохромированием. Таким способом можно практически почти все вещества и микроструктуры превратить в люминесцирующие. [38]
Такие мазки затем обрабатывают раствором примули-на ( 1: 500 - 1: 1000) на 2 % - ном водном растворе фенола. Левадити предпочитает обрабатывать препараты, содержащие вирусы, тиофлавином. За последнее время ряд авторов рекомендует применение акридинового оранжевого для флуорохромирования элементарных телец вирусов [19] как в свежих, так и фиксированных препаратах. [39]
Наиболее чувствительным к точному соблюдению всех условий опыта является акридиновый оранжевый. Так, было подтверждено наличие зависимости цвета флуоресценции бактерий от концентрации красителя. Для примулина с успехом можно пользоваться широким диапазоном значений рН среды при флуорохромировании, но для акридинового оранжевого изменение рН на единицу с 5 5 до 5 6 может привести к противоположному толкованию результатов. [40]
Подавляющее большинство микроорганизмов не обладает сколько-нибудь выраженной и характерной собственной люминесценцией. В этих случаях целесообразно производить исследование собственной люминесценции, во всех же остальных случаях приходится прибегать к флуорохромированию. Например, при изучении препаратов и мазков из тканей и жидкостей, подучае мых из организма животных и человека, образцов почв, а также центри-фугатов воды, водных смывов с различных предметов непосредственное флуорохромирование позволяет быстро и надежно обнаруживать в них бактерии и производить их количественный учет. О видовой принадлежности бактерий, выявленных прямым флуорохромированием, без дополнительных исследований судить трудно. [41]
Этот краситель дает яркую флуоресценцию всех микроорганизмов природной воды, разнообразных по видовому составу, хорошо дифференцирует бактериальные клетки от посторонних частичек. Лучшие результаты получены при флуорохромировании бактерий не в объеме пробы, а непосредственно на мембранном фильтре при помещении его бактериями вверх на поверхность раствора флуорохрома. Время флуорохромирования 15 мин при температуре 20 С. Необходимым условием является высушивание мембранных фильтров до и после флуорохромирования. Разработан ускоренный вариант метода. В этом случае для флуорохромирования используют горячий ( 7б С) раствор лактата этакридина, время экспозиции сокращают до 2 мин, а мембранные фильтры высушивают сухим жаром, что сокращает продолжительность операции в 10 раз. [42]
При изучении живого организма животных флуорохромом окрашивают обнаженную поверхность их органов или производят его внутреннее вливание. Током крови флуорохром разносится по организму и при освещении ультрафиолетовыми лучами ярко люминесцирует, окрашивая участки кожи или слизистой оболочки. Метод флуорохромирования используется также при изучении циркуляции крови и других жидкостей в организме. [43]
Вследствие очень высокой чувствительности люминесцентного метода для окрашивания используют сильно разведенные растворы флуорохромов ( С-10 - - 5 - 5 - 10 - 6 моль / л), химическое воздействие которых на исследуемый объект, и в частности на клетки организма, невелико. Это позволяет путем внутривенного или подкожного вливания проводить прижизненное флуорохромирование отдельных органов человека и животных, что имеет исключительно важное значение при биологических исследованиях. Так, прижизненное флуорохромирование красителем акридиновым оранжевым ( С-1: 1 105) позволяет наблюдать за функцион-ными состояниями клеток коры головного мозга различных животных, выявляя тончайшие структурные элементы мозговой ткани. [44]
Люминесцентный анализ обнаружения широко используют для контроля качества лекарственных препаратов и при изучении механизма их действия. Облучение пораженных участков кожи ультрафиолетовыми лучами позволяет быстро устанавливать природу заболевания и границы его распространения. Так, при флуорохромировании красителем акридиновым оранжевым удается отличать различные виды рака кожи и саркомы. [45]