Cтраница 2
Белки с разным количеством ионогенных радикалов в полипептидной цепи имеют в растворе разные заряды, поэтому в электрическом поле будут двигаться с разной скоростью. Обычно для их разделения используют электрофорез в полиакршшмидном геле. Перспективен также метод изоэлектрического фокусирования. [16]
Методы создания градиента рН подразделяются [9] на создание искусственного и естественного градиента. Однако при подаче на такую систему напряжения ионы начинают мигрировать, что приводит к быстрому смещению градиента. Ввиду нестабильности в электрическом поле искусственный градиент рН непригоден для изоэлектрического фокусирования в течение длительного времени. Все же Колин [8, 10] использовал искусственный градиент рН для изозлектрического фракционирования гемоглобина, каталазы и цитохрома с. Факт разделения он зарегистрировал через 4 мин после начала электролиза прямой фотосъемкой, однако такой процесс не мог продолжаться более длительное время. [17]
При изучении субъединичных белков и нуклеопротеидов аффинная модификация дает возможность понять, какие субъединицы участвуют в узнавании специфических лигандов. Субъединицы как белков, так и нуклеиновых кислот обычно идентифицируются в соответствии с их положением на хроматограмме, электрофореграмме, при изоэлектрическом фокусировании в зависимости от выбранной системы деления. Присоединение метки обычно не изменяет существенно положение макромолекулы в таких системах. Следовательно, проблема заключается в том, чтобы обнаружить среди разделенных субъединиц ту, которая содержит введенную метку. Трудности возникают в тех случаях, когда в качестве лиганда, несущего реакционноспособную группу, берется полимер. Присоединение молекул, несущих большой отрицательный заряд, может привести к сильному изменению положения модифицированного белка в используемой системе разделения. Следовательно, прежде чем проводить разделение, необходимо удалить специфическую макромолекулярную часть из модифицированного материала без разрушения связи метки с соответствующей субъединицей. [18]
Изоэлектрическое фокусирование включает электрофоретическую миграцию белка в условиях градиента рН, которая продолжается до тех пор, пока белок не достигнет такой области, где рН равен р / белка. Суммарный заряд белка становится равным нулю, и белок концентрируется в этой области в виде узкой зоны. Любое перемещение белка из-за диффузии в сторону от этой зоны ведет к восстановлению его электрического заряда и, следовательно, к электрофоретической миграции в обратном направлении. Итак, при изоэлектрическом фокусировании электрофорети-ческий массоперенос и зональная диффузия совместно обусловливают стационарность процесса. [19]
Амфолит, или амфотерный электролит, - это соединение, обладающее как кислотными, так и основными свойствами. В зависимости от рН среды его суммарный заряд принимает отрицательное, нулевое или положительное значение. Белки представляют собой наиболее подходящие объекты для изоэлектрического фокусирования. Для этой цели пригодны также многие низкомолекулярные природные соединения. Для создания естественного градиента рН используют преимущественно вещества с амфотерными свойствами. [20]
Значительная часть книги отведена описанию современных методов выделения и очистки белков с помощью электрофореза и гель-фильтрации. Следует отметить, что получение индивидуальных белков в высокоочищенном состоянии является необходимым условием любых структурных исследований. Поэтому разделы, посвященные теории и практике гель-фильтрации на колонках и в тонком слое, несомненно, окажутся полезными для широкого круга научных работников, так или иначе связанных с проблемой выделения чистых белков. Особый интерес представляет также весьма подробное описание метода очистки белков с помощью изоэлектрического фокусирования. Этот метод, ставший известным сравнительно недавно, позволяет достичь значительных успехов в разделении сложных смесей белков и день ото дня становится все более популярным. [21]
Сделать такие выводы позволяют результаты прямого - сравнения хроматографических свойств анализируемого вещества и подходящего стандарта. Однако, даже если соединения имеют одинаковую хроматографическую подвижность, утверждать, что они идентичны, по меньшей мере рискованно. Зто от-нюдь не означает, что хроматографические и электрофоретиче-ские методы малоинформативны. Они позволяют достаточно просто и быстро охарактеризовать исследуемые соединения, например определить степень полимеризации с помощью гель-хроматографии или установить изоэлектрическую точку с помощью метода изоэлектрического фокусирования. [22]