Репликативная форма

Cтраница 3

Прежде всего это относится к терминальной инициации, для осуществления которой могут использоваться как самозатравочный механизм, так и нуклеотид-белковая затравка. В первом случае предварительно необходимо перестроить двухспиральный тупой конец в структуру типа заячьи уши ( см. рис. 135), как это, по-видимому, происходит у репликативной формы парвови-русной ДНК. Поскольку спонтанная перестройка такого рода в изолированных молекулах ДНК крайне маловероятна по энергетическим соображениям, постулируется, что в ее осуществлении принимают участие какие-то ( пока не идентифицированные) белки. [31]

Прежде всего это относится к терминальной инициации, для осуществления которой могут использоваться как самозатравочный механизм, так и ну клеотид-белковая затравка. В первом случае предварительно необходимо перестроить двухспиральный тупой конец в структуру типа заячьи уши ( см. рис. 135), как это, по-видимому, происходит у репликативной формы парвови-русной ДНК - Поскольку спонтанная перестройка такого рода в изолированных молекулах ДНК крайне маловероятна по энергетическим соображениям, постулируется, что в ее осуществлении принимают участие какие-то ( пока не идентифицированные) белки. [32]

Прежде всего это относится к терминальной инициации, для осуществления которой могут использоваться как самозатравочный механизм, так и нуклеотид-белковая затравка. В первом случае предварительно необходимо перестроить двухспиральный тупой конец в структуру типа заячьи уши ( см. рис. 135), как это, по-видимому, происходит у репликативной формы парвови-русной ДНК - Поскольку спонтанная перестройка такого рода в изолированных молекулах ДНК крайне маловероятна по энергетическим соображениям, постулируется, что в ее осуществлении принимают участие какие-то ( пока не идентифицированные) белки. [33]

ДНК-зависимая РНК-полимераза может осуществлять транскрипцию ДНК нормальных клеток и ДНК-вирусов. Как же осуществляется синтез РНК у тех вирусов, которые в геноме вместо ДНК содержат РНК. Фермент также используется нуклеозидтрифосфаты для синтеза одноцепочечной вирусной РНК. Этот синтез должен пройти через стадию образования репликативной формы. Следовательно, на I стадии РНК-репликаза на матрице РНК-вируса специфически строит комплементарную, с противоположной полярностью цепь РНК. Последняя на II стадии служит матрицей для синтеза РНК, совершенно однотипной исходной вирусной РНК. Обе стадии катализируются одним и тем же ферментом, хотя в каждой из них участвуют различные белковые факторы. Следует особо подчеркнуть, что, поскольку РНК-репликаза имеет отношение только к вирусам, очевидно, на этом основании могут быть разработаны эффективные антивирусные лекарственные препараты. [34]

На молекулах репликативной формы ДНК происходит синтез не только () цепей ДНК, но и вирус-специфических мРНК - Следует сказать, что синтез мРНК должен предшествовать появлению новых молекул () цепей ДНК, так как без вирус-специфических мРНК в зараженной клетке не может появиться белок А. Трансляция фаговых мРНК приводит к накоплению вирус-специфических белков, в том числе и структурных, которые - при достаточной концентрации - начинают превращаться в сложные структуры - предшественники вирусного капсида. Генерируемые на этой стадии () кольца в результате специфических взаимодействий с белками фага вовлекаются в процесс сборки вириона. Тем самым предотвращается ставший уже ненужным переход () цепей в репликативную форму. [35]

На молекулах репликативной формы ДНК происходит синтез не только () цепей ДНК, но и вирус-специфических мРНК - Следует сказать, что синтез мРНК должен предшествовать появлению новых молекул () цепей ДНК, так как без вирус-специфических мРНК в зараженной клетке не может появиться белок А. Трансляция фаговых мРНК приводит к накоплению вирус-специфических белков, в том числе и структурных, которые - при достаточной концентрации - начинают превращаться в сложные структуры - предшественники вирусного капсида. Генерируемые на этой стадии ( - Ь) кольца в результате специфических взаимодействий с белками фага вовлекаются в процесс сборки вириона. Тем самым предотвращается ставший уже ненужным переход () цепей в репликативную форму. [36]

Удивительно, что внутри клеток в данном генетическом участке обычно транскрибируется только одна из двух цепей двойной спирали ДНК. Оказалось, что транскрибированная таким образом и выделенная из бактерий мРНК не гибридизуется с одноцепочечной ДНК фага 0X174, выделенной из зрелых вирусных частиц. Эту цепь ДНК обычно называют плюс-цепью. Это значит, что транскрибированная РНК также представляет собой плюс-цепь и, следовательно, транскрибируется с минус-цепи репликативной формы ДНК - Подтверждением этому выводу служит тот факт, что выделенная РНК легко гибридизуется с денатурированной двухцепочечной репликативной формой ДНК. [37]

Как и в случае одноцепочечных кольцевых ДНК в условиях, вызывающих разрыхление молекулы, кольцевая структура повышает устойчивость кон-формации. В структуре I обе цепи непрерывны; при помощи какого-то неизвестного механизма эти кольца образуют очень компактную суперспирализовапиую структуру. Если в том же месте разрывается и вторая цепь, то структура II превращается в линейную структуру III. ДНК вируса полиомы со структурами типа I, II и III имеют константы седиментации 20 3, 15 8 и 14 4 S соответственно. Идентификация этих двух кольцевых форм репликативной формы ДНК фага срХ174 основывается па следующих доказательствах [135, 136]: из структуры I в условиях денатурации ( 0 1 М NaOH, 10 мин или 12 % - ный формальдегид при 45, 14 час) не образуется вещество с величиной s, характерной для одиночных цепей. Если структуру I нагреть и быстро охладить, происходит полная ренатурация. Однако обработка структур I панкреатической ДНК-азой ( эндонуклеазой, расщепляющей одиночные цепи) приводит к появлению эквивалентного количества препарата, который седиментирует как структура II. Однако если структуру II денатурировать, то происходит полное превращение в молекулы, седиментирую щие как одпоцепочечные ДНК, а биологическая активность при этом возрастает. Известно, что биологическая активность одноцепочечных колец выше, чем двухцепочечных, а линейные одноцепочечныс ДНК биологически неактивны. Эти факты можно интерпретировать следующим образом: структура II способна к денатурации в результате одиночного разрыва в одной из двух цепей. Одна из цепей, отделившаяся от структуры II, должна быть кольцевой, поскольку эта структура обладает биологической активностью. Структура I состоит из двух непрерывных переплетений колец, обвитых одно вокруг другого так, что они не могут разойтись при денатурации; поэтому структура I после нагревания полностью ренатури-рует. [38]

Схема образования репликативной формы ДНК фага, содержащего с зрелом вирусе однонитевую ДНК. [39]

Механизм репликации, используемый для производства плюс епей, также нетрадиционен. Процесс начинается с образования в определенной точке в составе RF-I плюс - - цепи гидролитического разрыва, приводящего к появлению свободной 3 -гид-роксигруппы и, соответственно - концевой фосфомоноэфирной группы. У бактериофага ipX 174, механизм репликации которого изучен наиболее полно, разрыв происходит под действием специального, программируемого фаговой ДНК белка, известного как белок А. Разрывы, подобные тому, который образуется при действии на репликативную ДНК белка А, часто фигурируют в литературе под названием ник ( от англ. Двунитевая кольцевая ДНК с ником в плюс-цепи называется репликативной формой II или RF-II. Появившаяся гидро-ксигруппа играет роль праймера, с которого начинается процесс элонгации. Такая элонгация по своей сути означает синтез новой плюс-цепи, ковалентно связанной с исходной. [40]

Зная молекулярную массу двухцепо-чечной вирусной ДНК, можно определить ее физическую длину, так как молекулярная масса каждой нуклеотид-ной пары равна в среднем приблизительно 650, а на каждые 0 34 нм дуплекса, как мы уже видели, приходится одна нуклео-тидная пара. Типичным примером мелкого ДНК-содержащего вируса может служить бактериофаг Я. Двухцепочечная ДНК этого вируса имеет мол. ДНК многих других ДНК-содержащих вирусов также представляют собой кольцевые дуплексы. Некоторые вирусы, например бактериофаг Т2, содержат линейную двухцепочечную ДНК, т.е. молекулу с двумя концами, тогда как другие, например бактериофаг Х174, содержат молекулу ДНК, имеющую форму одноцепочечного кольца. В течение цикла репликации линейные ДНК часто переходят в кольцевую форму, а все одноцепочечные вирусные ДНК становятся двухцепочечными. Такие особые виды ДНК, которые появляются только в ходе репликации вируса, называются репликативными формами. [41]

Страницы: 1 2 3