Иммуноанализ

Cтраница 1

Иммуноанализ проводят следующим образом. Полистирольные пробирки ( 80ХП мм) покрываются антителами при обработке 1 мл раствора антител, Растворы антител разбавляют 0 1 М Na-карбонатного буфера ( рН 9 8) или фосфатным ( солевым) буфером. Пробирки с этими растворами оставляют на 3 ч при 37 С; для хранения раствор оставляют в пробирках на холоду. В каждую пробирку помещают 0 5 мл одного из следующих растворов: 1) стандартный раствор иммуноглобулина G, 2) неизвестный образец, 3) буферный раствор. Для разбавления используют фосфатный ( солевой) буферный раствор, содержащий 1 % сывороточного альбумина человека и 0 02 % азида натрия. Пробирки инкубируют при комнатной температуре в течение ночи ( 16 ч) на роторной мешалке так, чтобы поверхность, покрытая антителами, покрывалась 0 6 мл раствора, находящегося в каждой пробирке. Затем пробирки промывают три раза раствором NaCl-твин. Количество фермента, присоединенного к иммуноглобулину G, связанному стенками пробирок, покрытых антителами, определяют, добавляя 1 мл 0 05 М Na-карбонатного буфера ( рН 9 8), содержащего 1 мг / мл п-нитрофенилфосфата и 1 ммоль / л хлорида магния. [1]

Классический иммуноанализ, описанный Ялоу и Берсоном [1299], основан на способности немеченного антигена конкурировать с антигеном, меченным радиоактивным изотопом, при сорбции на связывающих центрах антитела, число которых ограниченно. [2]

Чрезвычайно чувствительный и избирательный иммуноанализ используется при определении концентраций молекул, к которым могут быть получены антитела. [3]

Поэтому типичный иммуноанализ можно рассматривать как сумму ряда компонентов системы, каждый из которых может быть индивидуаль - но доступен к кросс-реакции с поли - 2 пептидными фрагментами, заполимери - - зевавшимися полипептидами, предшественниками полипептидов или даже биологически не связанными полипептидами, включающими молекулярную конфигурацию, против которой направлен определенный тип антител в сыворотке. [4]

Широко распространенная версия иммуноанализа базируется на введении метки во вспомогательный белок, обладающий сродством к комплексу антиген - антитело. В этом случае детектируется трехкомпонентный комплекс антиген - антитело - меченый вспомогательный белок. Такой комплекс часто называют сэндвичем. Одна из наиболее широко используемых систем такого рода основана на использовании витамина биотина. Биотин описан в § 4.6, и его основная биологическая функция состоит в участии в качестве кофактора в ферментах, катализирующих реакции карбоксилирования, однако наряду с этим он обладает уникальным сродством к белку авидииу, содержащемуся в яичном желтке, и к его бактериальному аналогу стрептавидину. Оба эти белка являются тетрамерами, состоящими из четырех идентичных субъединиц, каждая из которых обладает активным центром для связывания биотина. Биотин может быть легко введен в антитело путем реакции его карбоксильной группы с какой-либо аминогруппой антитела. Далее для определения комплекса антиген - антитело можно использовать авидин в качестве носителя чувствительной метки, например конъюгат ави-дина с пероксидазой. [5]

Во всех случаях иммуноанализа первичной задачей является превращение анализируемого объекта в комплекс антиген - антитело с определением его количества. Однако развитие иммуноанализа все более смещается в область анализа малых количеств веществ, так что становится чрезвычайно актуальной чувствительность методов определения. Это достигается введением специальных меток в один из компонентов, участвующих в образовании специфического комплекса антиген - антитело. Для этой цели широко используют радиоактивные метки. Соответствующий метод называют радиоиммуноанализом. В последние десятилетия наблюдается тенденция замены радиоиммуноанализа нерадиохимическими методами детекции. Среди них наиболее широко используется иммуноферментный анализ. Он базируется на конъюгации одного из компонентов с определенным ферментом, который можно определить с очень высокой чувствительностью. Последняя достигается в результате образования огромного числа молекул продукта на каждую молекулу фермента. Одним из широко используемых с этой целью ферментов является рассмотренная в § 7.3 пероксидаза. Будучи конъюгирована с одним из компонентов специфического комплекса, она позволяет легко определить содержание конъюгированного с ней компонента либо по окрашиванию продукта, возникающего при добавлении Н20г и окисляемого органического субстрата, либо по интенсивности хемйлюминесценции в смеси Н20г с люминолом. Широко используется также щелочная фосфатаза из кишечника теленка. В качестве субстрата в этом случае используют 5 - Вг-4 - 1 - 3-индолилфосфат, который при отщеплении фосфата дает характерное окрашивание. [6]

Детекция методом молекулярной гибридиза-бактериальных штаммов на ции наличия в фекалиях пациентов патогенного штам - СПОСОбность продуцировать ма Е. noli, несущего ген энтеротоксина. [7]

Как и в иммуноанализе, в гибридизационном анализе в настоящее время интенсивно развиваются подходы к нерадиохимической детекции, в первую очередь на основе использования ферментов. С этой целью можно либо использовать зонды, содержащие ковалентно присоединенный фермент, либо ввести в зонд какие-либо группы, способные взаимодействовать с вспомогательным белком, конъюгированным с ферментом. [8]

Следует заметить, что иммуноанализ с регистрацией аналитического сигнала амперометрическим методом предложен сравнительно недавно. Наиболее многообещающие результаты достигнуты в тех случаях, когда датчики разрабатывались с учетом специфических требований электрохимического детектирования, а не приспосабливались к существующим методикам. Разработана конструкция датчика, состоящего из стеклоуглеродного электрода, поверхность которого модифицирована ковалентно пришитой од-носпиральной ДНК. После ее гибридизации с ДНК-мишенью регистрируют концентрацию дипиридильного комплекса Со ( Ш), который взаимодействует с двойной спиралью ДНК. При генетических нарушениях односпиральная ДНК не способна гибридизоваться с ДНК, взятой у больного человека. [9]

Существует несколько версий проведения иммуноанализа. Наиболее очевидным является применение прямого количественного иммуноанализа, при котором анализируемое вещество должно практически полностью перейти в комплекс. [10]

Анализ: традиционным методом является иммуноанализ с использованием диффузии в геле и подходящих антител. Требующиеся реактивы стоят очень дорого. На каждый анализ уходит несколько миллилитров таких реактивов. [11]

Чрезвычайно широкий спектр применений имеет иммуноанализ для определения как самого факта присутствия, так и измерения количества антигенов, в том числе гаптенов, т.е. низкомолекулярных соединений, к которым можно получить антитела, как правило, путем иммунизации животных конъюгатом гаптена с высокомолекулярным носителем, способным вызывать иммунный ответ. Иммуноанализ нашел широкое применение для анализа содержания различных гормонов, что имеет огромное значение для оценки состояния эндокринной системы человека и животных. Важное значение для оценки состояния окружающей среды, в первую очередь качества питьевой воды и пищевых продуктов, приобретает иммуноанализ содержания пестицидов. В связи с интенсивным развитием гибри-домной техники для анализа определенных антигенов все более широкое применение находят моноклональные антитела. [12]

В последние годы разработаны новые варианты иммуноанализа, используемые при массовых обследованиях населения для установления факта злоупотребления наркотическими препаратами. В основе этих методов лежит принцип иммунохроматографии. Все реагенты, необходимые для проведения анализа, нанесены в сухом виде на специальную полоску - стрип, с помощью которой при контакте с исследуемой пробой можно сразу на месте в считанные минуты увидеть результат определения. Вот почему именно эти способы анализа наиболее удобно использовать для экспресс-диагностики при скрининговых обследованиях населения. Имму-ноанализ на полосках отличается простотой исполнения, не требует дорогостоящего оборудования, специально обученного персонала, время анализа составляет 5 - 8 минут, позволяет без какой-либо обработки анализируемого образца получать предварительные результаты, свидетельствующие о наличии или отсутствии наркотического препарата в биологической жидкости человека. [13]

Величина этого параметра определяет возможность применения тех или других антител. Иммуноанализ и гистохимические методы требуют антител с высоким сродством ( / ССв10 - 9 - 10 - 10), чтобы комплексы антигена с антителами были очень прочными С другой стороны, имму-ноаффинная очистка лучше осуществляется с низкоаффинными антителами ( КсвЮ - 6 - 10 - 7), поскольку в этих условиях адсорбция и освобождение антитела проходят при относительно мягких условиях без повреждения антигена и антител и колонка может использоваться повторно. Анализ взаимодействия антител с антигеном проводят по методу Скэтчарда ( см. с. [14]

Страницы: 1 2