Cтраница 2
Ингвал и др. [324] применили принцип радиоиммуноанализа, описанный для определения кроличьего иммуноглобулина G; однако вместо меченных радиоактивным изотопом антигенов они конъюгировали последние с ферментом - щелочной фосфатазой. Основой конкурентного иммуноанализа является разделение свободных и связанных с антителами антигенов, так чтобы антигены можно было определить количественно. [16]
Во всех случаях иммуноанализа первичной задачей является превращение анализируемого объекта в комплекс антиген - антитело с определением его количества. Однако развитие иммуноанализа все более смещается в область анализа малых количеств веществ, так что становится чрезвычайно актуальной чувствительность методов определения. Это достигается введением специальных меток в один из компонентов, участвующих в образовании специфического комплекса антиген - антитело. Для этой цели широко используют радиоактивные метки. Соответствующий метод называют радиоиммуноанализом. В последние десятилетия наблюдается тенденция замены радиоиммуноанализа нерадиохимическими методами детекции. Среди них наиболее широко используется иммуноферментный анализ. Он базируется на конъюгации одного из компонентов с определенным ферментом, который можно определить с очень высокой чувствительностью. Последняя достигается в результате образования огромного числа молекул продукта на каждую молекулу фермента. Одним из широко используемых с этой целью ферментов является рассмотренная в § 7.3 пероксидаза. Будучи конъюгирована с одним из компонентов специфического комплекса, она позволяет легко определить содержание конъюгированного с ней компонента либо по окрашиванию продукта, возникающего при добавлении Н20г и окисляемого органического субстрата, либо по интенсивности хемйлюминесценции в смеси Н20г с люминолом. Широко используется также щелочная фосфатаза из кишечника теленка. В качестве субстрата в этом случае используют 5 - Вг-4 - 1 - 3-индолилфосфат, который при отщеплении фосфата дает характерное окрашивание. [17]
Существует несколько версий проведения иммуноанализа. Наиболее очевидным является применение прямого количественного иммуноанализа, при котором анализируемое вещество должно практически полностью перейти в комплекс. [18]
Однако это весьма грубый тест, ибо в ряде случаев от - g - 5 0 сутствие параллельности кри - вых не так просто практически заметить. Поэтому, например, в иммуноанализе ( там особенно часто наблюдается кросс-реактивность) для подтверждения идентичности определяемого лиганда со стандартным препаратом анализ проводят с использованием двух или более различных сывороток. Идентичность получаемых результатов в этом случае - более обоснованное указание на то, что определяемый лиганд и стандартный препарат имеют одинаковую природу. Дальнейшие исследования кривых разведения при использовании других стандартных препаратов и соответствующих нескольких сывороток позволяют уменьшить вероятность ошибки идентификации определяемого соединения. [19]
Метод гомогенного ИФА без использования твердой фазы основан на различии каталитических свойств ферментной метки в свободном виде и в иммунном комплексе. В настоящее время термин гомогенный имму-ноанализ применяют к любой системе иммуноанализа, в которой специфическая реакция взаимодействия антигена с антителом и регистрация глубины ее протекания осуществляются в гомогенном растворе. [20]
Например, два лиганда LI и L2 реагируют с центром связывания Qi, а с центром связывания Q2 реагирует только лиганд LI, в этом случае кривые разведения не будут параллельными. Поэтому при наличии нескольких центров связывания данные кривых разведения более информативны и достоверны ( Ekins, Newman, 1970) и иммуноанализ, в котором обычно присутствует несколько типов центров связывания, дает более надежные результаты по сравнению с методами, основанными на одном типе центров связывания: рецепторными, на основе специфических связывающих белков. [21]
Методы, основанные на образовании комплексов антител с антигенами или гаптенами, называют иммуно-аналиэом. Иммуноанализ используется либо для определения определенных антигенов с помощью специфических к этим антигенам антител, либо, наоборот, для детекции антител определенной специфичности с помощью соответствующих антигенов. И та, и другая задача имеет широкий спектр применений в фундаментальных биохимических исследованиях, в биотехнологии, в медицинской практике и для оценки состояния окружающей среды. [22]
Этот метод неконкурентного сэндвича состоит из трех стадий: 1) определяемый антиген реагирует с покрытым антителами целлюлозным иммуносорбентом; 2) меченные ферментом антитела инкубируют с антигеном, связанным на твердой фазе; 3) затем измеряют ферментативную активность иммуносорбента. В качестве примера применения этого метода может служить определение а-фетопротеина. Использование ферментативного иммуноанализа позволило Като и др. [619] определять такие небольшие количества иммуноглобулина G человека, как 3 фмоль. [23]
Чрезвычайно широкий спектр применений имеет иммуноанализ для определения как самого факта присутствия, так и измерения количества антигенов, в том числе гаптенов, т.е. низкомолекулярных соединений, к которым можно получить антитела, как правило, путем иммунизации животных конъюгатом гаптена с высокомолекулярным носителем, способным вызывать иммунный ответ. Иммуноанализ нашел широкое применение для анализа содержания различных гормонов, что имеет огромное значение для оценки состояния эндокринной системы человека и животных. Важное значение для оценки состояния окружающей среды, в первую очередь качества питьевой воды и пищевых продуктов, приобретает иммуноанализ содержания пестицидов. В связи с интенсивным развитием гибри-домной техники для анализа определенных антигенов все более широкое применение находят моноклональные антитела. [24]