Cтраница 2
Многочисленные примеры из обширной области использования иммуносорбентов обоих типов ( с иммобилизованными антителами и антигенами) были приведены в предыдущей книге данной серии [ Остерман, 1983 ], поэтому мы ограничимся лишь тремя примерами, относящимися к рассматриваемой проблеме аффинной очистки нуклеиновых кислот. С помощью иммуносорбентов здесь удается решить довольно своеобразные задачи. [16]
Антитела выделяют из сыворотки центрифугированием при 20 000 g в течение 1 ч при 4 С. После удаления липидных веществ иммуносорбент смешивают с сывороткой и суспензию 2 ч перемешивают магнитной мешалкой при 4 С. Коиъюгат целлюлозы центрифугируют при 20 000 g в течение 20 мин. Адсорбент вновь суспендируют в ОД5М растворе хлорида натрия и центрифугируют еще 10 мин при той же скорости. [17]
В связи с элюированием антител интересно наблюдение Мерфи и др. [27], касающееся увеличения аффинности антител при иммунизации. Например, антитела против глюкагона можно эффективно элюировать с иммуносорбента 4 25 М спиртом в 4 мМ соляной кислоте, однако если они были приготовлены из сыворотки того же кролика через 1 год, то для элюирования следует использовать 0 1 М уксусную кислоту, доведенную до рН 2 2 муравьиной кислотой. [18]
Далее будут приведены примеры аффинного фракционирования и очистки самих нуклеиновых кислот, в том числе на иммуносорбентах. Основное внимание уделим более простому и универсальному методу - неспецифической элюции, однако биоспецифическая аффинная элюция белков тоже будет представлена несколькими типичными примерами. Рассмотрение начнем с использования сорбентов с индивидуальной специфичностью, ограничившись здесь тремя примерами, поскольку нет смысла пытаться сколько-нибудь полно иллюстрировать бесчисленное разнообразие возможных сорбентов этого типа. Аффинная хроматография белков клеточного метаболизма на сорбентах с групповой специфичностью будет иллюстрирована подробнее, а затем последуют два примера использования ковалентной хроматографии. [19]
Там же была рассмотрена возможность связывания любых антител на матрице, несущей белок А из Staphylococcus aureus. Естественно, что иммуносорбенты используются и в обратном варианте, когда с помощью лигандов-антител производится очистка антигенов белковой природы или гаптенов. [20]
Важной группой аффинных сорбентов являются иммобилизованные антитела, или антигены. В первом случае сорбенты могут быть использованы для специфического выделения определенных антигенов, или галтенов, из сложных смесей. В этом случае эти сорбенты называют иммуносорбентами. Во втором случае иммобилизованные антигены способствуют выделению антител с определенной специфичностью из сложной смеси антител. [21]
Полученные препараты активированной сефарозы используют для иммобилизации НАД-зависимых дегидрогеназ. При данной степени активации тетрамерные молекулы глицеральдегид-3 - фосфатдегидроге-назы и лактатдегидрогеназы связываются с матрицей только через одну из субъединиц. Для связывания ферментов за несколько субъединиц и для получения иммуносорбентов препараты сефарозы активируют большим количеством BrCN: 50 - 250 мг на 1 г сефарозы. При высоких степенях активации предпочтительно использовать раствор BrCN в диоксане, а не в воде, так как в первом случае его растворимость значительно выше. [22]
Иммунохимия, и иммунология, методы применяются не только для диагностики заболеваний ( выявление, специфичных антител в крови заболевших), но также 1 и для определения и идентификации белков в сложных смесях по их антигенным свойствам. Он основан на осаждении антител антигеном и определении количества белка, выпавшего в осадок. Более универсальным является метод определения абсолютного количества антител по приросту белка на иммуносорбентах. [23]
Корь у сотрудников больниц часто протекает атипично и не сразу распознается. Как правило, признаками кори является появление пятнисто-папулезной сыпи, чему предшествует трех-четырехдневное лихорадочное состояние. У пациентов впервые инфицированных и без предыдущей иммунизации выделение вируса или обнаружение антигена затруднено, однако для быстрой постановки диагноза могут использоваться фермент-сопряженный иммуносорбент или флуоресцентные про. У людей с предыдущими иммунизациями затруднена интерпретация этих анализов, но может оказаться полезным метод иммуно-флюоресцентной окраски антитела отшелушенных клеток. [24]
Недавно было описано и запатентовано приготовление сферических гранул полиакролеина размером 50 - 150 мкм. Лпганды, несущие аминогруппу, или белки, диффундируя через агарозу, связываются с альдегидными группами полиакроленпа при комнатной температуре и физиологических значениях pll через шиффовы основания. Позже был предложен новый тип матрицы для приготовления иммуносорбентов. [25]
Несмотря на мягкость аффинного взаимодействия, возможны ситуации, когда такая процедура инактивирует белок. В этих случаях сорбцию на аффинном сорбенте можно попытаться использовать для решения обратной задачи, ведущей к тому же результату - для задержания на нем примесей. Разумеется, ввиду многочисленности и разнообразия примесных белков для этой цели нельзя использовать сорбенты с индивидуальной или даже групповой специфичностью. Однако решение может быть найдено на путях использования иммуносорбентов с полиспецифической антисывороткой против всей совокупности примесных белков. [26]
Характерным биологическим свойством белка А является его способность взаимодействовать с молекулами различных иммуноглобу-линов G из разных видов животных. Белок ковалентно связан с сефарозой CL - 4B с помощью бромцианового метода. А - сефароза CL - 4В - характеризуется высокой химической и механической стабильностью. Сорбент устойчив в области рН 2 - 11 и может выдерживать относительно высокие концентрации денатурирующих агентов, таких, как мочевина и гуанидинхлорид, а также не изменяется в присутствии хаотропных солей, таких, как 3 М роданид калия, который обычно используется для элюирования связанных молекул с иммуносорбента. Гель поставляется в лиофиль-но высушенном виде, в него добавляются декстран и лактоза. При хранении в холодильнике при 8 С этот иммуносорбент сохраняет свою емкость по иммуноглобулину по крайней мере в течение двух лет. [27]
Характерным биологическим свойством белка А является его способность взаимодействовать с молекулами различных иммуноглобу-линов G из разных видов животных. Белок ковалентно связан с сефарозой CL - 4B с помощью бромцианового метода. А - сефароза CL - 4В - характеризуется высокой химической и механической стабильностью. Сорбент устойчив в области рН 2 - 11 и может выдерживать относительно высокие концентрации денатурирующих агентов, таких, как мочевина и гуанидинхлорид, а также не изменяется в присутствии хаотропных солей, таких, как 3 М роданид калия, который обычно используется для элюирования связанных молекул с иммуносорбента. Гель поставляется в лиофиль-но высушенном виде, в него добавляются декстран и лактоза. При хранении в холодильнике при 8 С этот иммуносорбент сохраняет свою емкость по иммуноглобулину по крайней мере в течение двух лет. [28]