Cтраница 2
Существование ковалецтных фермент-субстратных производных было продемонстрировано для ряда ферментов, причем число таких ферментов все время растет. Этот список включает в настоящее время химотрипсин, трипсин, триозофосфатдегидрогеназу, фосфоглюкомутазу, мутазу фосфогли-цериновой кислоты, несколько фосфатаз, несколько альдолаз, декарбокси-лазу ацетоуксусной кислоты и некоторые другие ферменты. В нескольких случаях фермент-субстратные промежуточные продукты оказались термодинамически достаточно устойчивыми, что позволило осуществить их выделение и изучение. [16]
Фермент, катализирующий вышеприведенную реакцию, найден у растений. Потребность этого фермента в 2 3-дифосфоглицериновой кислоте в качестве кофермента указывает на то, что он подобен фосфоглюкомутазе. Однако фосфо-фермент еще не найден; при исследовании выделенного из мышцы кролика очищенного фермента не установлена потребность его в ионах металла. Получены данные, что в некоторых растительных тканях, возможно только в семенах, содержится какая-то фосфоглицеромутаза, которая не требует 2 3-дифосфоглицериновой кислоты; этот фермент катализирует прямое превращение 3-фосфоглицериновой кислоты в 2-фосфогли-цериновую. [17]
При химической и ферментативной деградации фосфорилированного фермента образуется фосфосерин, связанный по С-концу с остатком гистидина. Аналогичным способом может быть получена и изучена фосфорилированная мутаза фосфоглицериновой кислоты, которая по ряду своих свойств весьма близка к фосфоглюкомутазе. [18]
Супернатант доводят аммиаком до рН 7 0 и медленно добавляют сухой сульфат аммония до 45 % - ного насыщения. К супернатанту добавляют сульфат аммония до 75 % - ного насыщения при постоянном перемешивании. Осадок, содержащий фосфоглюкомутазу, собирают центрифугированием и растворяют в 1 мМ растворе Na2HPO4, рН 6 8, содержащем 0 1 мМ ЭДТА. Раствор диализуют в течение ночи против того же буфера. [19]
При фосфоролизе группы ОРО3Н2 присоединяются к глюкозным группам гликогена в положении 1, что ведет к распаду гликогена на молекулы глюкозо-1 - фосфата. Последний, при действии фосфатазы печени, отщепляет фосфорную кислоту и дает глюкозу, которая, при действии гексокиназы, снова фосфорилируется, давая глюкозо-6 - фосфат. Превращение глюкозо-1 - фосфата в глюкозо-6 - фосфат идет также и без промежуточного образования глюкозы, в присутствии энзима фосфоглюкомутазы. В дальнейших стадиях, как и при брожении, глюкозофосфаты превращаются в пировино-градную кислоту, которая в животном организме восстанавливается до молочной кислоты. Во всех стадиях фосфорилирования и дефосфорили-рования переносчиком фосфора служит система АТФ-АДФ-А. [20]
При фосфоролизе группы ОР03Н2 присоединяются к глюкозным груп - Пам гликогена в положении 1, что ведет к распаду гликогена на молекулы глюкозо-1 - фосфата. Последний, при действии фосфатазы печени, отщепляет фосфорную кислоту и дает глюкозу, которая, при действии гексокйназы, - снова фосфорилируется, давая глюкозо-6 - фосфат. Превращение глюкозо - - 1-фосфата в глюкозо-6 - фосфат идет также и без промежуточного образования глюкозы, в присутствии энзима фосфоглюкомутазы. В дальнейших - стадиях, как и при брожении, глюкозофосфаты превращаются в пиро-виноградную кислоту, которая в животном организме восстанавливается до молочной кислоты. Во всех стадиях фосфорилирования и дефосфори-лирования переносчиком фосфора служит система АТФ-АДФ-А. [21]
В данной задаче ферментативный процесс прекращают, нагревая пробы в кипящей водяной бане. В связи с этим в пробы 1 и 2 ( до инкубации) добавляют инактивированный нагреванием экстракт. Инактивацию проводят следующим образом: наливают в пробирку 3 мл экстракта и помещают в кипящую водяную баню на 5 мин, после чего охлаждают во льду. Пробы 3 - 4 перед добавлением субстрата преинкубируют в присутствии имидазольного буфера и Mg 2 при комнатной температуре 15 мин для активации фосфоглюкомутазы. В пробы добавляют субстрат и все четыре пробы ( 1 - 4) инкубируют 30 мин в водяном термостате при 30 С. По окончании инкубации пробы нагревают в кипящей водяной бане в течение 2 мин и помещают в лед. Во все пробы приливают по 2 мл дистиллированной воды и в случае необходимости фильтруют. [22]
Ионы металлов в белках и ферментах выполняют ряд каталитических и структурных функций. О структурной роли ионов металлов в биологических системах свидетельствует существование многочисленных ферментов, в которых ионы металла непосредственно не участвуют в каталитическом акте, но оказываются необходимыми для выполнения этими ферментами их биохимической функции. Таким образом, ионы металлов в белках и ферментах можно условно подразделить на два класса: химические и структурные металлы. Химические металлы - те, которые принимают непосредственное участие в биохимической реакции, например в окислительно-восстановительных реакциях пер-оксидаз и ферредоксинов или в связывании кислорода гемоглобином. Структурные металлы либо стабилизируют конформацию фермента, необходимую для выполнения его биологической функции, как, например, кальций ( П) в термолизине, либо косвенно промотируют катализ, обеспечивая необходимую ориентацию субстратов или каталитических групп белка, например магний ( П) в фосфоглюкомутазе. [23]
Особое значение индуцированное соответствие имеет для целого ряда ферментов, переносящих ацильные или фосфорильные группы из одного нуклеофильного центра в другой. Ацилхимо-трипсины служат примером случая низкой специфичности в отношении нуклеофила. Ацетил - [114] и фуроилхимотрипсин [62] легко реагируют, наравне с водой, со всеми типами спиртов, перенося ацильную группу на ROH с образованием сложного эфира. Неспецифический ацильный перенос такого рода, очевидно, неприемлем в тех случаях, когда целью действия фермента является перенос ацильной группы на специфический рецептор, но, поскольку размер молекулы любого спирта превышает размер молекулы воды, полностью удалить последнюю из активного центра невозможно. В этой ситуации фермент должен выбрать между ROH и НОН путем гарантирования того, что НОН в реакцию не вступит, и индуцированное соответствие обеспечивает механизм специфичности этого типа. Ярким примером такой специфичности является перенос фосфорильной группы на глюкозу, катализируемый фосфоглюкомутазой и гексокиназой. [24]
Все названные ферменты представляют собой гидролитические ферменты, и настройка их на тот или иной субстрат зависит, по-видимому, от общего топохимического плана строения молекул. Интересные результаты были получены Шормом при инактивировании лизиновых остатков химотрипсина посредством обработки динитрофенолом. Если заместить четыре лизиновых остатка динитрофенильными группами, то протеазная активность фермента снижается на 2 / з, а эстеразная остается практически без изменения. Замещение двух остатков лизина вызывает даже повышение эстеразной активности. С другой стороны, имеются примеры, когда значительное изменение структуры фермента, по-видимому, не затрагивающее активного центра, не сказывается на величине активности. Из папаина можно отщепить цепочку из 120 аминокислот; остающийся пептид содержит 60 звеньев и обладает активностью. Таким образом, очень большое число прихотливо расположенных участков в белковой молекуле может так или иначе влиять на уровень активности и субстратную специфичность. Доказано, что фосфоглюкомутаза, переносящая фосфатную группу с одного глюкозного конца на другой, имеет активный центр той же природы, что и активный центр трипсина. Этот пример особенно отчетливо показывает, насколько широк каталитический спектр молекул белков. [25]