Cтраница 2
В случае некоторых небольших полимеров гидролиз концевого фосфата ( фосфатов) под действием очищенной фосфомоноэстеразы дает независимую оценку длины цепи из соотношения количества общего фосфора к количеству фосфора, выделенному в виде неорганического фосфата; исследование оставшегося полинуклеотида уточняет природу концевых звеньев. Применение такого рода методов до некоторой степени ограничено высокой степенью чистоты, необходимой для применяемых ферментов, и изменением активности моноэсте-раз ( и диэстераз) с изменением длины цепи полимера. [16]
Ксли в формуле ( VI) группа R является остатком полпнуклсотидной цепи, то этот метод, очевидно, должен дать возможность удалять конечный остаток без затрагивания всей полинуклеотидной цени. Последняя после такой обработки должна теперь иметь конечный остаток у атома С3 - удаление же остатка из этого положения под действием специфической фосфомоноэстеразы является разработанным приемом, приводящим к освобождению а-гликольной системы, пригодной для повторения процесса. Этот метод успешно применялся по отношению к небольшим олигопуклеотидам 23 ], образующимся в результате ферментативного гидролиза рибонуклеиновой кислоты. Но его нельзя применять в отношении самих рибонуклеиновых кислот до тех пор, пока не будет освоена методика получения однородной нуклеиновой кислоты. Отсутствие до настоящего времени такой методики мешает успешному применению описанного метода относительно самих кислот, хотя возможности его очевидны. [17]
Существует большое число ферментов, способных отщеплять фосфатные группы от моно -, олиго - и полинуклеотидов. Некоторые из них обладают специфичностью в том отношении, что удаляют только 5 - или только З - фосфатные группы. Из неспецифичных фосфомоноэстераз, отщепляющих фосфаты вне зависимости от их положения как от моно -, так и от полинуклеотидов, широко используются две фосфомоноэстеразы. [18]
Нуклеотид, участвующий в контроле синтеза РНК Escherichla со / /, был выделен ионообменной хроматографией, и методом ультрафиолетовой спектроскопии показано, что он содержит гуанин. По специфической цветной реакции установлено также наличие в нем рибозы. Гидролиз меченого нуклеотида фосфомоноэстеразой показал, что он содержит четыре фосфатных остатка на молекулу гуанозина. Маловероятно, что хотя бы один из этих фосфатных остатков присоединен к гетероциклическому основанию, поскольку это привело бы к значительному изменению УФ-спектра гуанина. Нуклеотид стабилен к действию периодата-следовательно, какие-то из фосфатных остатков должны быть присоединены к 2 - или З - гидроксиль-ной группе сахара. Подвижность нуклеотида в процессе ионообменной хроматографии при различных значениях рН указывала на то, что для него характерны четыре первичные и две вторичные диссоциирующие группы фосфорильных остатков. Фосфодиэстераза змеиного яда, расщепляющая связь между а - и р-фосфатными остатками в нуклеозид-5 - полифосфатах, расщепила нуклеотид до трифосфата и, следовательно, его структура должна соответствовать гуанозин-3 5 -дипирофосфату ( 16) или - 2 / 5 -дипирофосфату. [19]
Не все нуклеиновые кислоты можно получить биосинтети - чески со специфической радиоактивностью, достаточно высокой для применения метода фингерпринтирования. Получающиеся этим способом меченые олигонуклеотиды можно затем подвергать двумерному фракционированию подобно тому, как это описано выше. Обычно нерадиоактивные олигонуклеотиды получают комбинированным воздействием специфической эндонуклеазы и фосфомоноэстеразы. В результате фингерпринты с олигонуклеотидами, меченными по 5 -концу ( с дефосфорилированным Зг-концом), практически не отличаются от полученных в результате эндонуклеазного гидролиза равномерно меченной нуклеиновой кислоты. [20]
Расщепление полинуклеотидов с концевой фосфатной группой гладко протекает лишь при использовании химических методов деградации, при расщеплении же под действием ферментов существенным условием быстрого протекания реакции является отсутствие фосфатной группы на З - конце полинуклеотидной цепи в случае фосфодиэсте-разы змеиного яда и на 5 -конце - в случае фосфодиэстеразы селезенки ( см. стр. По этой причине перед ферментативным расщеплением необходимо удаление концевых фосфатных групп действием фосфомоноэстеразы, что приводит к исчезновению специфического фрагмента, образующегося из фосфорилированного конца цепи. [21]
Эта реакция катализируется ферментом полинуклеотидкина-зой, которая выделяется из клеток E. Как показано на схеме, заметного фосфо-рилирования свободных 2 - и 3 - ОН - групп не происходит. Если в исходной молекуле нуклеиновой кислоты 5 - ОН фос-форилирован, свободную 5 - ОН-группу получают в результате обработки фосфомоноэстеразой. [22]
Существует большое число ферментов, способных отщеплять фосфатные группы от моно -, олиго - и полинуклеотидов. Некоторые из них обладают специфичностью в том отношении, что удаляют только 5 - или только З - фосфатные группы. Из неспецифичных фосфомоноэстераз, отщепляющих фосфаты вне зависимости от их положения как от моно -, так и от полинуклеотидов, широко используются две фосфомоноэстеразы. [23]
Для ДНК концевая метка может быть введена ферментативным путем. Чаще всего для этой цели используют фермент полинуклеотидкиназу, специфически катализирующую перенос остатка фосфорной кислоты от молекулы АТФ к 5 -гидроксигруппе 5 -концевого фрагмента ДНК. Этот фрагмент производится в E. Если исходная ДНК содержит в 5 -положении остаток фосфорной кислоты, то его можно предварительно удалить с помощью другого фермента - фосфомоноэстеразы ( щелочной фосфатазы), катализирующей отщепление ортофосфата от моноэфиров фосфорной кислоты. [24]