Cтраница 2
Каждую из четырех смесей фрагментов подвергают электрофорезу на пластинке геля в условиях, обеспечивающих разделение фрагментов в соответствии с числом содержащихся в них нуклеотидных остатков независимо от того, какие это остатки. Точное положение каждого меченого фрагмента в геле определяют радиоавтографией. [16]
Во-первых, исследование структуры клонированных генов развития показало, что они кодируют белки, связывающиеся с ДНК - Во-вторых, наличие клонированных генов позволило изучить характер пространственной экспрессии этих генов. Если гены, играющие важную роль Б процессе развития, клонированы, то можно выявить те клетки и районы тела эмбриона, в которых они экспрессируются. Для исследования транскрипции гена срезы тканей эмбриона гибридизуют с мечеными фрагментами ДНК клонированного гена. [17]
На рис. 1 результаты первого способа фрагментации, в котором выщеплялись остатки С, сопоставлены с электрофоретической картиной, показывающей расположение полученных при этом способе фрагментов длиной от 1 до 10 остатков. Здесь было обнаружено два меченых фрагмента. Очевидно, это именно те фрагменты, которые содержат 5 -конец исходного олигонуклеотида. Меченые фрагменты найдены в положениях, соответствующих олигонуклеотидам длиной в три и шесть остатков. Ясно, что в исходном нуклеотиде после этих меченых фрагментов в направлении к З - концу стоял остаток С, поскольку в химической процедуре, приведшей к расщеплению исходного олигонуклеотида, выщеплялся только этот остаток. Таким образом, в результате первой химической обработки мы узнали, что в положениях 4 и 7 ( отсчитывая с 5 -конца) исходного олигонуклеотида должны располагаться остатки С. [18]
В результате обнаружения явления необратимого ингибиро-вания холинэстераз органическими фосфорными соединениями и того факта, что фосфорильный остаток вида ( RO) 2P O соединяется с ферментом, возникла новая возможность изучения структуры активной поверхности. Если фосфорильный радикал пометить изотопом, то последующее разложение молекулы инги-бированного фермента должно дать меченый фрагмент, представляющий собой исходный компонент, который прореагировал с ингибитором. В такого рода исследованиях фосфорильный радикал неизменно получается связанным с р-гидроксилом серина. Естественно возникает вопрос, представляет ли выделенный меченый фрагмент первичный комплекс фермент-ингибитор, образующийся на активной поверхности, или же он является вторичным продуктом, получающимся в результате перефосфори-лирования во время гидролиза. [19]
Ряд гомейотических генов и генов сегментации был успешно клонирован благодаря тем ухищрениям, которые, с одной стороны, предоставила технология получения рекомбинантных ДНК, а с другой - классическая генетика, накопившая бесценный багаж знаний о точной локализации этих генов в хромосомах. Во-первых, исследование структуры клонированных генов развития показало, что они кодируют белки, связывающиеся с ДНК - Во-вторых, наличие клонированных генов позволило изучить характер пространственной экспрессии этих генов. Если гены, играющие важную роль в процессе развития, клонированы, то можно выявить те клетки и районы тела эмбриона, в которых они экспрессируются. Для исследования транскрипции гена срезы тканей эмбриона гибридизуют с мечеными фрагментами ДНК клонированного гена. [20]
На рис. 1 результаты первого способа фрагментации, в котором выщеплялись остатки С, сопоставлены с электрофоретической картиной, показывающей расположение полученных при этом способе фрагментов длиной от 1 до 10 остатков. Здесь было обнаружено два меченых фрагмента. Очевидно, это именно те фрагменты, которые содержат 5 -конец исходного олигонуклеотида. Меченые фрагменты найдены в положениях, соответствующих олигонуклеотидам длиной в три и шесть остатков. Ясно, что в исходном нуклеотиде после этих меченых фрагментов в направлении к З - концу стоял остаток С, поскольку в химической процедуре, приведшей к расщеплению исходного олигонуклеотида, выщеплялся только этот остаток. Таким образом, в результате первой химической обработки мы узнали, что в положениях 4 и 7 ( отсчитывая с 5 -конца) исходного олигонуклеотида должны располагаться остатки С. [21]
Ряд гомейотических генов и генов сегментации был успешно клонирован благодаря тем ухищрениям, которые, с одной стороны, предоставила технология получения рекомбинантных ДНК, а с другой - классическая генетика, накопившая бесценный багаж знаний о точной локализации этих генов в хромосомах. Во-первых, исследование структуры клонированных генов развития показало, что они кодируют белки, связывающиеся с ДНК. Если гены, играющие важную роль в процессе развития, клонированы, то можно выявить те клетки и районы тела эмбриона, в которых они экспрессируются. Для исследования транскрипции гена срезы тканей эмбриона гибридизуют с мечеными фрагментами ДНК клонированного гена. [22]
Интерес представляет своеобразный метод определения последовательности нуклеотидов в элюированных после первого этапа сравнительно коротких ( 10 - 15 звеньев) олигонуклеотидах, получивший название mobility shift analysis. Проводят неполный гидролиз каждого олигонуклеотида нуклеазой Р1 в алик-вотах в течение 2, 5, 10 и 20 мин. Эндонуклеаза Р1 атакует олиго-нуклеотид в любом месте, разрывая фосфодиэфирную связь между З - ОН и 5 -фосфатом. Она способна полностью гидролизовать олиго нуклеотид до 5 -монофосфатов, но условия и продолжительность гидролиза в аликвотах подбирают так, чтобы в результате получить набор всех возможных его фрагментов. При дальнейшем анализе ауторадиографически обнаруживаются только фрагменты, несущие 32Р, введенный на 5 -конец целого олигонуклеотида. При соблюдении указанных условий гидролиза полный набор таких меченых фрагментов содержит цепочки с любым числом звеньев ( п) - от [ 5 - 32Р ] моно-фосфата до целого [ 5 - 82Р ] олигонуклеотида. Важно подчеркнуть, что фрагмент каждой длины представлен только одной последовательностью нуклеотидов, начинающейся с меченного 32Р 5 -концевого нуклеотида. Все вырезанные из середины или прилегающие к 3 -концу олигонуклеотида фрагменты оказываются немечеными. [23]