Cтраница 1
Гидрофобная хроматография - жидкостная хроматография на неполярных сорбентах, в которой п качестве подвижной фазы используются водные или водно-органические буферные растворы и разделение смеси веществ происходит в результате различия в их взаимодействии с гидрофобными группами сорбента в условиях убывающего градиента солей в элюенте. [1]
Эффективность гидрофобной хроматографии на агарозе повышается, если ее поверхность модифицируют закреплением на ней гидрофобных молекул. Все эти и некоторые другие аналогичные производные агарозы выпускает фирма Miles. При хроматографии на аминоалкилагарозах наряду с гидрофобными взаимодействиями во фракционировании белков участвуют, по-видимому, также и ионные. На 1 мл набухшего геля приходится 15 - 20 мкмоль алкильных заместителей, что позволяет сорбировать до 10 мг белка. Фирма обращает внимание потребителей на то, что связи между алкильными цепями и агарозой не абсолютно прочные и может наблюдаться небольшое подтекание заместителей. Это не снижает характеристик колонок, однако между экспериментами их рекомендуется промывать 1 М NaCl и водой, а затем снова уравновешивать рабочим буфером. [2]
Согласно Шальтье [48], гидрофобная хроматография была первым из используемых методов очистки белков и других био - цогических молекул. [3]
Из вышеизложенного следует, что в гидрофобной хроматографии необходимо делать различие между сорбентами только с гидрофобными группами и сорбентами, содержащими наряду с гидрофобными также ионные группы. [4]
Ранее подчеркивалось, что смысл градиентной элюции при обрат-нофазовой гидрофобной хроматографии заключается в постепенном увеличении растворимости задерживаемых на матрице белков в водном элюенте. [5]
Использование растворов солей для элюирования выделяемых веществ с сорбентов в гидрофобной хроматографии рассмотрено в разд. Иеннисен и Хейлмейер [20] показали, что элюирующая способность анионов соответствует их расположению в ряду Гофмейстера и элюирующая способность катионов обратна их высаливающему или всаливающему действию. Соли способны проникать непосредственно между белком и гидрофобной поверхностью сорбента, что приводит к десорбции белка. Если за адсорбцию ответственны ионные взаимодействия, то элюирование белков должно зависеть от ионной силы раствора, но не от природы и типов используемых солей. [6]
Гидрофобные свойства первых использованных пространственных групп послужили причиной возникновения нового типа хроматографии, а именно гидрофобной хроматографии, которая далее развивалась как самостоятельный метод. В этом методе важную роль играет гидрофобная пространственная группа. Однако если в аффинной хроматографии делаются попытки использовать преимущественно специфические взаимодействия участков связывания, например фермента и ингибитора, то предпочтение отдается пространственным группам гидрофильного характера. [7]
Она создает возможность осуществления разделений на основе взаимодействия участков с гидрофобной поверхностью макромолекул, так называемой гидрофобной хроматографии, которая может быть сравнена с такими общими методами, как ионообменная хроматография или гель-фильтрация. Наиболее часто используемыми сорбентами в гидрофобной хроматографии являются агарозы, к которым после активации бромцианом присоединены алкиламины. Йост и др. [21] показали, однако, что при присоединении алкил - или ариламинов к агарозе, активированной бромцианом, образуются сильные ионооб-менники с кажущимся р / ( - 10 для амидинового азота. Используя заряженные гидрофобные лиганды, получают сорбенты, которые функционируют как детергенты, прочно сорбирующие некоторые ферменты, которые частично денатурируют при выделении. [8]
При очистке мембранных белков детергенты бывают необходимы и для экстракции белка из липидного окружения мембраны, и для поддержания его ферментативной активности в растворе ( в какой-то мере имитируя это липидное окружение), и, наконец, в процессе самой гидрофобной хроматографии. Экспериментатору приходится гибко манипулировать последовательным выбором природы и концентрации различных детергентов для решения всех этих задач. [9]
Фенил-ага-роза наряду с гидрофобным взаимодействием проявляет специфичность к ароматическим веществам ( например к белкам с феноловыми и тирозиловыми группами) на основе я-л взаимодействия ароматических остатков. Элюирование веществ при гидрофобной хроматографии достигается изменением ионного состава раствора, понижением его ионной силы или полярности ( например посредством включения этиленгликоля в состав элюента) или с помощью детергентов. [10]
Она создает возможность осуществления разделений на основе взаимодействия участков с гидрофобной поверхностью макромолекул, так называемой гидрофобной хроматографии, которая может быть сравнена с такими общими методами, как ионообменная хроматография или гель-фильтрация. Наиболее часто используемыми сорбентами в гидрофобной хроматографии являются агарозы, к которым после активации бромцианом присоединены алкиламины. Йост и др. [21] показали, однако, что при присоединении алкил - или ариламинов к агарозе, активированной бромцианом, образуются сильные ионооб-менники с кажущимся р / ( - 10 для амидинового азота. Используя заряженные гидрофобные лиганды, получают сорбенты, которые функционируют как детергенты, прочно сорбирующие некоторые ферменты, которые частично денатурируют при выделении. [11]
В этом виде хроматографии неподвижная фаза представлена твердой поверхностью снаружи и внутри гранул сорбента - в их порах. Для пористых сорбентов, как и в случае гидрофобной хроматографии, имеет место эффект гель-фильтрации, поскольку жидкость внутри пор неподвижна, но по сравнению с адсорбцией этот эффект невелик и мы его опять учитывать не будем. На поверхности сорбента, вообще говоря, могут сорбироваться не только молекулы фракционируемого вещества, но и молекулы элюента, которые могут даже конкурировать с веществом за одни и те же участки поверхности. Однако обычно молекулы вещества обладают намного большим сродством к сорбенту, чем элюент, и такая конкуренция играет второстепенную роль. Равновесное распределение вещества между неподвижной и подвижной фазами определяется процессами его сорбции и десорбции на поверхности сорбента, которые в немалой степени зависят от природы элюента, но не столько в плане конкуренции за центры сорбции на поверхности, сколько в том смысле, что от характера элюента зависит растворимость вещества в жидкости подвижной фазы. [12]
Это соединение, будучи привязанным к се-фарозе, использовано Гендерсоном и др. [18], а также Якубовским и Павелкевичем [21] в качестве сорбента для гидрофобной хроматографии аминоацил-т РНК-синтетаз и L-гистидинолфосфат-аминотрансфераз. Торая и др. [40] предложили его в качестве биоспецифического сорбента для аминооксидазы из Aspergillus niger, в то же время Восбек и др. [44], выделяя с помощью того же сорбента аминопептидазы из Streptomyces griseus, не пришли к определенному заключению о типе связи, образующейся при специфической сорбции. [13]
Все эти методы имеют много общих черт; это касается также и типичной биоспецифической аффинной хроматографии. Как правило, они основаны на образовании специфических комплексов биологически активных веществ, причем один из компонентов в комплексе иммобилизован на нерастворимой матрице. Методы приготовления специфических сорбентов практически идентичны; общими являются такие проблемы, как влияние нерастворимого носителя и пространственная доступность иммобилизованного лиганда. Часто трудно определить, имеет ли место типичное биоспецифическое связывание или все же преобладают неспецифические гидрофобные взаимодействия, например если сорбция происходит на носителе, модифицированном гидрофобной пространственной группой. Тем не менее можно ожидать, что по крайней мере некоторые из перечисленных разовьются в самостоятельные методы, особенно гидрофобная хроматография, которая использует нековалентные взаимодействия гидрофобных участков на поверхности белковых молекул с гидрофобными литандами, связанными с нерастворимыми носителями. [14]
Интерфероны фибробластов и лейкоцитов человека, индуцируемые комплексом полиинозиновой - полииитидиловой кислот и вирусом, различаются по своей антигенности. Например, антитела, образуемые против интерферона фибробластов, не способны нейтрализовать интерферон лейкоцитов. Антитела, образуемые против препаратов интерферона лейкоцитов, обладают частично перекрестной активностью к интерферону фибробластов, которая, однако, может объясняться присутствием интерферонов фибробластного типа в этих лейкоцитарных препаратах. Причины различий антигенного поведения могут быть обусловлены первичными структурами полипептидных цепей и посттрансляционными модификациями ( гликозилированием) или и тем и другим. Поскольку поверхность белка отражает его первичную структуру, а гидрофобные аминокислоты на поверхности определяют взаимодействия с гидрофобными сорбентами, Янковский и др. [580] решили сравнить поведение обоих интерферонов при гидрофобной хроматографии различного типа. [15]