Cтраница 2
Все эти методы имеют много общих черт; это касается также и типичной биоспецифической аффинной хроматографии. Как правило, они основаны на образовании специфических комплексов биологически активных веществ, причем один из компонентов в комплексе иммобилизован на нерастворимой матрице. Методы приготовления специфических сорбентов практически идентичны; общими являются такие проблемы, как влияние нерастворимого носителя и пространственная доступность иммобилизованного лиганда. Часто трудно определить, имеет ли место типичное биоспецифическое связывание или все же преобладают неспецифические гидрофобные взаимодействия, например если сорбция происходит на носителе, модифицированном гидрофобной пространственной группой. Тем не менее можно ожидать, что по крайней мере некоторые из перечисленных разовьются в самостоятельные методы, особенно гидрофобная хроматография, которая использует нековалентные взаимодействия гидрофобных участков на поверхности белковых молекул с гидрофобными литандами, связанными с нерастворимыми носителями. Изучение влияния концентрации подходящего связанного лиганда и нахождение оптимальных концентраций солей в ходе сорбции и десорбции могут привести к тому, что гидрофобная хроматография наряду с гель - и ионообменной хроматографией станет стандартным методом очистки различных типов соединений. [16]
Вместо предпочтительного растворения ( например, для ХОФ) в певодной неподвижной жидкой фазе имеет место прямое гидрофобное взаимодействие молекул вещества с органическими молекулами алифатической или ароматической природы, фиксированными на поверхности твердой матрицы. Взаимодействие происходит в водной или водно-орга-ннческой жидкой среде. Если, как нередко бывает, в хроматогра-фическом процессе участвует только наружная поверхность химически модифицированных гранул носителя, то этой средой является сама подвижная фаза элюента. Если же поры в гранулах достаточно крупные и гидрофобное взаимодействие вещества с модифицированной поверхностью матрицы происходит по всему их объему, то жидкая полярная среда того же состава, что и элюеит, оказывается здесь иммобилизованной и ее следовало бы считать тоже неподвижной фазой в том смысле, какой придается этому понятию при гель-фильтрации. Однако значения коэффициента распределения ( К) при гель-фильтрации близки к единице, тогда как гидрофобное взаимодействие молекул вещества с гидрофобизированной поверхностью матрицы обеспечивает К 1, что позволяет пренебрегать эффектом гель-фильтрации в описываемом методе хроматографии. Этот метод лишь условно можно отнести к распределительной хроматографии, поэтому, описывая его в данной главе после истинно распределительной хроматографии в обращенных фазах ( ХОФ), мы будем именовать его методом обратпофазовой гидрофобной хроматографии. Аналогичный термин нормальнофазовая гидрофильная хроматография не фигурирует в нашем рассмотрении, поскольку возможный вариант гидрофильного взаимодействия вещества с поверхностью матрицы в среде органического растворителя в колоночной хроматографии биологических молекул не применяется. [17]
Касаи и Ишии [22] нашли, что для сорбции трипсина на сефарозе с присоединенным глицилглицилар-гинином оптимальным является рН 5 6, однако это значение не является оптимальным для катализа. Следовательно, полезно определить оптимальные условия образования каждого индивидуального комплекса выделяемого вещества с иммобилизованным аффинным лигандом. Из рис. 3.1 следует, что повышение ионной силы буфера приводит к снижению количества сорбированного химотрипсина. Такое возрастание задержки выхода нельзя, однако, объяснить увеличением ионной силы, поскольку положение пика фермента не меняется, если ионную силу 0 05 М фосфатного буфера увеличить, добавляя раствор 0 9 М хлорида натрия. Задержка выхода фермента имеет место не только в фосфатно-цитратном буфере, но также в сульфатном или фосфатном; однако степень задержки выхода, конечно, различна. Для ряда карбоновых кислот, используемых при доведении 0 5 М гидрофосфата натрия до рН 6 0, найдено, что задержка выхода фермента возрастает с увеличением основности кислот в такой последовательности: ацетат сукцинатцитрат. Ребо и др. [33] отмечают, что наиболее важными факторами, влияющими на адсорбцию белков на алкил - сефарозе, являются наряду с длиной алифатической цепи концентрация и природа присутствующих в среде солей. Важная роль солей в гидрофобной хроматографии детально рассмотрена в разд. [18]
Ионизированные группы в составе хроматографируемого вещества, например на поверхности белка, хорошо гидратируются, что препятствует гидрофобному взаимодействию с сорбентом. Ионизацию стараются подавить соответствующим выбором рГ1 элюента. Однако следует помнить, что сам силикагель устойчив только в интервале рН 2 - 7 5; при щелочных значениях рН он постепенно растворяется водой. Поэтому при наличии в веществе кислых ионоген-ных групп в состав элюента вводят нейтрализующие их контрионы. Нередко в качестве таковых выбирают относительно крупные малоподвижные заряженные группы. В процессе хроматографии они остаются в непосредственной близости к ионогеиным группам вещества, образуя с ними ионные пары. Выбор химической природы тяжелых контрионов позволяет управлять силой гидрофобного взаимодействия вещества с сорбентом. Если контрионы несут в своей структуре гидрофобные функции, то они могут усиливать это взаимодействие, если же контрионы гидрофильны, то с их помощью гидрофобное взаимодействие вещества с сорбентом можно контролируемым ( иногда избирательным) образом ослабить. Хроматографию, использующую этот прием, называют иногда ион-парной гидрофобной хроматографией, а чаще - просто ион-парной хроматографией. Хотя в последнем наименовании гидрофобность выпала, следует помнить, что оно обозначает лишь определенную модификацию основного процесса обратнофазовой гидрофобной хроматографии. [19]
Обсуждая влияние солей, следует отметить, что фракционирование белков основано на гидрофобной высаливающей адсорбции на неионных амфифильных гелях, для которой Порат и др. [40] ввели термин гидрофобная высаливающая хроматография. Ам-фифилыные гели получаются при введении ограниченного числа гидрофобных групп в вещества, которые используются как гидрофильные гели, при этом образуются сшитые полимеры, обладающие высокой проницаемостью и способные набухать как в воде, так и во многих органических растворителях. В водных растворах они проявляют сродство к растворенным гидрофобным веществам и соединениям с гидрофобными группами. Следовательно, неионные амфифильные гели демонстрируют чистое гидрофобное взаимодействие с гидрофобными областями на поверхности белковых молекул или других растворенных веществ вместо смешанной ио нно-гидрофобной адсорбции производных атарозы. В определенных условиях адсорбционная емкость амфифильных гелей по белкам может быть очень высока. В присутствии ЗМ хлористого натрия сорбция экстракта и элюиров-ание отдельных фракций осуществляется путем повышения фН, снижения ионной силы и уменьшения полярности растворителя. После использования этой колонки более 20 раз и с 50-кратным количеством белка ( относительно сухого веса геля) гидрофобный сорбент не изменяет своих хроматографических свойств. Принцип, который лежит в основе высаливающей адсорбции, до конца не ясен. Очевидно, главной движущей силой является возрастание энтропии вследствие изменения структуры воды, окружающей гидрофобные группы. Гидрофобная хроматография может иметь преимущества в растворах с высокой ионной силой, которые используются при выделении нестабильных ферментов, например а-изопропилмалатизомеразы [4], требующих для стабилизации высоких концентраций солей. [20]