Cтраница 3
Затем, выращивая гибридные клетки в питательной среде, в которой чисто мышиные клетки неспособны свободно развиваться, они обнаружили, что некоторые гибриды производят новый белок ( в результате деятельности генов), так как они оказались способными расти в этой питательной среде. Из этого ученые сделали вывод, что новый продукт ( белок) есть результат деятельности хромосом человека в гибридных клетках. [31]
Для картирования с использованием радиационных гибридов ( РГ-картирования) не нужно собирать родословные и генотипировать членов банка СЕРН-семей. В основе метода лежит работа с соматическими клетками и скрининг ( с использованием ПЦР-зондов) клеточных линий, содержащих части ( фрагменты) хромосом человека. РГ-картирование целой хромосомы или какой-то ее области начинается с создания гибридной ( человек / грызун) клеточной линии, содержащей одну хромосому человека. Клетки такой монохромосомной гибридной клеточной линии подвергают воздействию летальных доз ионизирующей радиации ( рентгеновских или гамма-лучей), в результате чего разрушаются клеточные мембраны, инактивируются ферменты, происходит фрагментация хромосом. Один рад равен 0 01 Дж на 1 кг ткани или 100 эргам на 1 г ткани. Обычно клетки в культуре погибают при 3000 рад. [32]
ДНК, весьма трудоемок и часто дает ошибочные результаты. Все эти проблемы удалось решить, когда Вебер и Мэй обнаружили, что по всему геному человека разбросано множество высокополиморфных ди -, три - и тетрануклеотидных повторов ( коротких тандемных повторов; STS, от англ, short tandem repeats), вариации которых легко различаются при помощи ПЦР. STR, особенно динуклеотидные тан-демные повторы, эффективны как маркеры; в этом качестве они уже вытеснили ПДРФ-локусы и в настоящее время используются для построения подробных генетических карт всех хромосом человека. [33]
Объединенная комиссия ФАО и ВОЗ по Пищевому кодексу ( Codex Alimentarins) включила в число обязательных компонентов пищевых продуктов и напитков, подвергаемых контролю при международной торговле, 8 наиболее токсичных элементов: ртуть, кадмий, свинец, мышьяк, медь, олово, цинк и железо. Утверждение этого списка вовсе не означает, что другие элементы являются безвредными. По крайней мере, еще 6 - 7 элементов в некоторых продуктах и в определенных концентрациях могут представлять опасность для здоровья человека. Например, мутации хромосом человека вызывают хром, бериллий, мышьяк, никель, ртуть, кадмий, свинец, а раковые опухоли - мышьяк, никель, бериллий, свинец, кадмий, ртуть. [34]
В период между делениями, называемый интерфазой, хромосомы практически неразличимы в световом микроскопе как обособленные структуры, хотя материал, из которого они состоят, окрашивается некоторыми основными красителями и потому назван хроматином. На этой стадии хромосомы представляют собой клубок длинных тонких нитей. Непосредственно перед делением ядра они закручиваются в гораздо более компактные и более интенсивно окрашивающиеся структуры, которые короче, толще и более обособлены друг от друга. На рис. 23.1 представлена фотография хромосом человека в клетке, находящейся на стадии метафазы. [35]
За четыре года, прошедших со времени выхода в свет первого издания книги Молекулярная биотехнология: принципы и применение, в области биотехнологии было сделано огромное количество открытий. Открыты и охарактеризованы многие гены, ассоциированные с различными заболеваниями человека, неизмеримо возрос объем клинических испытаний в области генной терапии. Построены подробные генетические и физические карты хромосом человека; впервые из дифференцированной соматической клетки клонировано жизнеспособное млекопитающее. Производство одного из трансгенных растений, сои, поставлено на коммерческую основу. [36]
РГ-карты не только имеют более высокое разрешение, но и являются более полными, чем генетические. Кроме того, РГ-картирование проще мейотического в техническом плане, а новые сайты можно быстро включать в ранее построенную РГ-карту. К сожалению, РГ-картирование не позволяет локализовать гены тех или иных заболеваний в специфических районах хромосомы. Несмотря на это при построении мультилокусных карт хромосом человека РГ-картирование, вероятно, вытеснит картирование по сцеплению, основанное на генотипиро-вании членов СЕРН-семей. [37]
Затем, выращивая гибридные клетки в питательной среде, в которой чисто мышиные клетки неспособны свободно развиваться, они обнаружили, что некоторые гибриды производят новый белок ( в результате деятельности генов), так как они оказались способными расти в этой питательной среде. Из этого ученые сделали вывод, что новый продукт ( белок) есть результат деятельности хромосом человека в гибридных клетках. В ультрафиолетовом свете полоски ярко проступили, и одна-единствен-ная оставшаяся в клетках хромосома человека была определена как источник того белка, который создавали гибридные клетки. [38]
На втором уровне нуклеосомы объединяются в хроматиновую фибриллу толщиной 25 - 30 нм. В одной петле содержится от 5 до 50 тысяч пар нуклеотидов. Такая многоэтажная иерархия структур приводит к чрезвычайно плотной упаковке ДНК. Так, в 46 хромосомах человека содержится около 1 м ДНК, а упакована она в ядре размером в несколько микрон. [39]
XIII, пол у человека определяется обычным механизмом XX-XY, распространенным и у других двуполых организмов. Это в свою очередь позволяет объяснить наличие сцепленных с полом признаков, которые обусловлены генами, локализованными в Х - или Y-хромосоме. В отношении остальных 22 пар хромосом человека наши сведения пока еще очень отрывочны. Данные о сцеплении генов относятся преимущественно к случаям сцепленного с полом наследования. Известно также несколько примеров множественного аллелиз-ма, например в отношении групп крови, принадлежащих к системе А, В, 0 ( см. гл. [40]
Как полагает Соваге [ Sovage, 1982 ], аберрации хромосом могут приводить к изменению антигенной структуры оболочки клетки, но их эффект зависит от степени дифференцировки клетки. И очень мала вероятность повреждения того небольшого участка функционирующего генома, который детерминирует этот процесс даже при наличии большого числа аберраций хромосом в клетке. В эпидермисе, по мнению этого ученого, имеется строгое давление отбора против клеток с аберрациями хромосом, уступающих по своим пролиферативным свойствам нормальным клеткам. Имеются сведения, показывающие, что при мутациях наблюдается изменение числа и структуры рецепторов на оболочке клетки. С помощью моноклональных антител показано [ Волгин и др., 1983 ], что утрата хромосомы человека в гетерокариоиах человек - мышь сопровождается исчезновением определенных детерминант клеточной оболочки. [41]
До недавнего времени мало было известно о локализации генов в хромосомах человека. Исключение составляли лишь признаки, сцепленные с полом ( гл. В, 4), которые могут быть локализованы в Х - хромосомах. Для слияния человеческих лимфоцитов с клетками грызунов часто используют инактивированный вирус Сендай, обладающий способностью вызывать сначала адгезию, а затем слияние клеток. Из гибридных клето-к, полученных в результате слияния человеческих клеток с клетками мыши или хомяка, можно получить линии клеток, ядра в которых также сливаются. Хотя такие клетки могут размножаться, давая много поколений, тем не менее они склонны утрачивать при этом хромосомы, особенно те из них, которые ведут свое происхождение от клеток человека. Наблюдая за утратой определенных биохимических признаков, например некоторых ферментов, специфических для человека ( которые могут быть отделены от ферментов хомяка методом электрофореза), можно установить наличие или отсутствие определенного гена в данной хромосоме. Очевидно, что для этого необходимо одновременно следить за потерей хромосом на каждой стадии эксперимента. Новые методы окрашивания позволяют идентифицировать каждую из 26 пар хромосом человека. [42]
В настоящее время наметилась тенденция к переходу на менее чувствительный, но зато легко поддающийся автоматизации флуоресцентный метод. С этой целью либо к праймеру, либо к терминирующим ддНТФ присоединяют специальные красители, дающие при облучении лучом лазера интенсивную флуоресценцию. В специальных приборах для автоматическою секвенирования по ходу электрофореза в некоторой области геля проводится непрерывная регистрация интенсивности флуоресценции и ее спектральных характеристик. Таким образом, ход разделения фиксируется сразу во время электрофореза. При этом для анализа распределения вдоль синтезируемой цепи ДНК каждого из четырех нуклеоти-дов используют четыре разных красителя, отличающихся спектрами флуоресценции. Анализируя спектры каждой полосы, проходящей через регистрирующее устройство, можно сразу определить, какому красителю, а следовательно, какому нуклеотиду эта полоса соответствует, т.е. проводить определение последовательности на одной дорожке вместо четырех. В сочетании с достаточно мощными ЭВМ, обеспечивающими быструю обработку спектральных данных, поступающих с большого числа дорожек геля, можно одновременно анализировать много образцов. Этот подход положен в основу создания техники, позволяющей на одном приборе определять последовательности нескольких сотен тысяч нуклеотидов в течение суток. Такие темпы стали весьма актуальны в связи с уже ведущимися работами по установлению полной первичной структуры ДНК всех хромосом человека ( структуры генома человека), которые содержат несколько миллиардов пар нуклеотидов. [43]