Cтраница 2
В результате сделались доступными для исследования индивидуальные гены и регулятор-ные генетические элементы, было стимулировано изучение ферментов биосинтеза и обмена нуклеиновых кислот. Благодаря этому после 1977 г. были обнаружены мозаичное ( экзон-интронное) строение генов, явление сплайсинга и ферментативной активности у РНК, усилители ( энхансеры) экспрессии генов, многие регуля-торные белки, онкогены и онкобелки, мобильные генетические элементы. Возникла белковая инженерия, которая позволяет получать новые, не существующие в природе белки. [16]
Следует отметить, что для проведения полимеразной цепной реакции вполне подходят неизмененные формы термостабильных ДНК полимераз. Использование же этих ферментов для определения нуклео-тидных последовательностей ДНК требует некоторой их модификации. Кроме самой полимеразной активности ДНК полимеразы, как правило, содержат еще и 5 - 3 -, и 3 - 5 -экзонуклеазные активности, нежелательные для секвенирования. Так, белковой инженерией был удален один домен ДНК полимеразы T. Однако, такая ЛГд ДНК полимераза, к сожалению, сохранила присущую ей строгую избирательность по отношению к типу включаемых ею в новую цепь ДНК нуклеотидтрифосфатов, и в связи с этим требовались дополнительные исследования, направленные на выяснение особенностей работы данных ферментов. [17]
В будущем открываются широкие возможности для конструирования новых ферментов. Одна из них - направленное изменение отдельных аминокислот путем изменения генов, которые кодируют ферменты. Мы все глубже познаем законы, по которым белки принимают специфическую трехмерную конфигурацию, поэтому не исключено появление в ближайшем будущем совершенно новых сконструированных ферментов. Это направление называется белковой инженерией. Кроме того, чем больше мы узнаем о том, как работают ферменты, тем более вероятно, что мы сможем сконструировать небелковые или частично небелковые катализаторы, которые гораздо стабильнее, чем обычные ферменты. Возможно, именно это направление окажется самым привлекательным для предпринимателей. Среди направлений, которые окупятся немедленно, - поиск природных ферментов, являющихся более совершенной альтернативой используемым в настоящее время. Все это требует огромных инвестиций в исследования и разработки. [18]
Первая контролируемая модификация белка была проведена в середине 60 - х годов Кршландом и Бендером. Однако, как выяснилось, такой тиолсубтилизин не сохраняет протеазную активность. Вообще говоря, методы химической модификации не только жестки и неспецифичны; они плохи еще и тем, что с их помощью невозможно вызвать множественные желаемые изменения, особенно если модифицируемые аминокислотные остатки погружены в глубь третичной структуры белка. Для этого нужна белковая инженерия, основанная на генетической инженерии. Сегодня она осуществляется при помощи двух хорошо освоенных методов ( гл. Так, сайт-специфический мутагенез осуществляется следующим образом. Клонируют ген того белка, который интересует исследователя, и встраивают его в подходящий генетический носитель. Затем синтезируют олигонуклеотидную затравку с желаемой мутацией, последовательность которой из десяти - пятнадцати: нуклеотидов в достаточной степени гомологична определенному участку природного гена и поэтому способна образовывать с ним гибридную структуру. Эта синтетическая затравка используется полимеразами для начала синтеза комплементарной копии вектора, которую затем отделяют от оригинала и используют для контролируемого синтеза мутантного белка. Альтернативный подход основан на расщеплении цепи, удалении подлежащего изменению сайта и замещении его синтетическим аналогом с желаемой последовательностью нуклеотидов. [19]
Редактирование, происходящее в процессе эволюции, затрагивает биологически функциональную часть глобулы, ее активный центр. Активный центр белка-фермента включен в каркас, обладающий некоторой конформационной подвижностью. Точная структура каркаса не играет определяющей роли. Поэтому структура белка как целого мало связана с его функцией. Это создает важные возможности для белковой инженерии, для искусственного построения белков, применимых в биоэлектронике. Первые шаги в этом направлении уже сделаны. [20]
В литературе появляются работы, в которых делаются попытки прогнозирования дальнейшего развития энзимологии на ближайшее десятилетие. Перечислим основные направления исследований энзимологии будущего. В-пятых, исследования в области инженерной энзимологии ( белковая инженерия), создание гибридных катализаторов, сочетающих свойства ферментов, антител и рецепторов, а также создание биотехнологических реакторов с участием индивидуальных ферментов или полиферментных комплексов, обеспечивающих получение и производство наиболее ценных материалов и средств для народного хозяйства и медицины. Наконец, исследования в области медицинской энзимологии, основной целью которых является выяснение молекулярных основ наследственных и соматических болезней человека, в основе развития которых лежат дефекты синтеза ферментов или нарушения регуляции активности ферментов. [21]