Клонированный ген

Cтраница 3

Очень часто для решения биотехнологических и некоторых других задач бывает необходимо знать полную нуклеотидную последовательность клонированного гена. Для секвенирования используют несколько методов; один из них - ди-дезокси-метод, разработанный Сангером и др. В его основе лежит остановка синтеза цепи после присоединения к ней дидезоксинуклеотида. У такого нуклеотида отсутствует З - гидроксильная группа, и дальнейший рост цепи становится невозможным. Для секвенирования в разных пробирках одновременно проводят четыре реакции синтеза ДНК, каждая - в присутствии одного из четырех дидезоксинуклеотидов. Продукты реакций разделяют с помощью гель-электрофореза, проводят радиоавтографию и считывают с радиоавтографа нуклеотидную последовательность синтезированного фрагмента ДНК. [31]

Образование случайно ориентированных тандемных повторов. А. Клонированные гены вырезают из клонирующего вектора с помощью рестрицирующей эндонуклеазы Abel и отделяют от векторной ДНК. Б. Создают условия, при которых происходит сшивание вырезанных генов. Поскольку нуклеотидные последовательности обоих выступающих концов генов одинаковы, последние могут соединяться в любой ориентации. В результате образуются тандемные повторы из случайно ориентированных последовательностей. [32]

Наличие сильного регулируемого промотора - это очень важное, но недостаточное условие максимизации количества продукта клонированного гена. Большую роль играют также эффективность трансляции и стабильность самого продукта. В прокариотических клетках разные мРНК не всегда транслируются с одинаковой эффективностью. Различие может составить несколько сотен раз, и в результате в клетке будут присутствовать сотни или даже тысячи копий одних белковых молекул и лишь несколько копий других. [33]

Во-первых, исследование структуры клонированных генов развития показало, что они кодируют белки, связывающиеся с ДНК - Во-вторых, наличие клонированных генов позволило изучить характер пространственной экспрессии этих генов. Если гены, играющие важную роль Б процессе развития, клонированы, то можно выявить те клетки и районы тела эмбриона, в которых они экспрессируются. Для исследования транскрипции гена срезы тканей эмбриона гибридизуют с мечеными фрагментами ДНК клонированного гена. [34]

Однако химическая модификация белков редко бывает строго специфичной и ее необходимо осуществлять заново для каждого белкового препарата, поэтому лучше вносить изменения в его клонированный ген. К сожалению, не всегда бывает известно, какую именно аминокислоту или последовательность аминокислот нужно изменить, чтобы получить белок с нужными физическими, кинетическими или химическими свойствами. Может случиться, что изменения должны затрагивать два или более аминокислотных остатка, расположенных далеко друг от друга в полипептидной цепи, но сближающихся в результате укладки белковой молекулы. Есть надежда, что уже в недалеком будущем с помощью компьютеров удастся предсказывать свойства того или иного белка, исходя из данных о его аминокислотной последовательности. Это значительно упростит процедуру создания нужных белков. Введение новой генетической информации в клонированные гены сейчас не составляет особого труда, однако чтобы определить, обладает ли искомый белок нужными свойствами, необходимо проанализировать множество белковых продуктов. [35]

Проиллюстрировав возможность клонирования генов, Коэн и др. создали экспериментальную базу для технологии рекомбинантных ДНК, показали, что плазмиды могут служить носителями и векторами клонированных генов. Последующие работы очень скоро привели к созданию более сложных векторов и стратегий клонирования. Все это вызвало серьезную озабоченность относительно безопасности и этичности подобных экспериментов, и чтобы снять обеспокоенность общественности, были разработаны официальные инструкции и созданы правительственные органы, регламентирующие работы с ре-комбинантными ДНК. Завершая перечень тех последствий, к которым привела публикация работы Коэна и др., отметим, что она самым непосредственным образом повлияла на становление молеку-лярно-биотехнологической индустрии. [36]

Состав и прочность клеточной стенки зависят от условий культивирования, скорости роста клеток, фазы, на которой они собираются, условий хранения сконцентрированных клеток и от того, экспрессировал ли выделенный микроорганизм клонированный ген. [37]

Для инициации транскрипции в нужном сайте необходим промотор, а для ее остановки - терминирующий кодон. Клонированный ген часто бывает лишен таких сигнальных последовательностей, и для его экспрессии в прокариотической клетке-хозяине нужно обеспечить и то, и другое. Кроме того, поскольку для решения большинства биотехнологических задач белок должен образовываться в больших количествах, необходимо использовать промотор, который позволял бы получить высокий уровень транскрипции ( сильный промотор) и распознавался РНК-полимеразой хозяйской клетки. Постоянная транскрипция клонированного гена истощает энергетические ресурсы хозяйской клетки, поэтому нужно использовать промоторы, работу которых можно регулировать либо с помощью специфических низкомолекулярных соединений, либо изменением температуры. [38]

Отбор и сохранение тех хозяйских клеток, которые экспрессируют клонированный ген. Наследование клонированного гена возможно только в случае его интеграции в хромосому клеток хозяина. [39]

Ряд гомейотических генов и генов сегментации был успешно клонирован благодаря тем ухищрениям, которые, с одной стороны, предоставила технология получения рекомбинантных ДНК, а с другой - классическая генетика, накопившая бесценный багаж знаний о точной локализации этих генов в хромосомах. Во-первых, исследование структуры клонированных генов развития показало, что они кодируют белки, связывающиеся с ДНК - Во-вторых, наличие клонированных генов позволило изучить характер пространственной экспрессии этих генов. Если гены, играющие важную роль в процессе развития, клонированы, то можно выявить те клетки и районы тела эмбриона, в которых они экспрессируются. Для исследования транскрипции гена срезы тканей эмбриона гибридизуют с мечеными фрагментами ДНК клонированного гена. [41]

Один из них основывается на присоединении к клонированному гену - без нарушения рамки считывания - сегмента ДНК, кодирующего короткую аминокислотную последовательность, которая специфически связывается с каким-либо химическим элементом, соединением или макромолекулой. Такую конструкцию встраивают в экспрессирующий вектор между промотором и сайтом терминации транскрипции. Короткая аминокислотная последовательность в составе рекомбинантного белка, синтезируемого в хозяйской клетке, играет роль аффинной метки. [42]

Рекомбинантные белки, синтезируемые в системах экспрессии S. cerevisiae. HIV-1 - вирус иммунодефицита человека 1 типа. [43]

Стратегия с использованием векторов второго типа пока не получила широкого распространения, несмотря на то что в результате интеграции экспрессирующего вектора или транскриптона в хромосомную ДНК получается стабильный ре-комбинантный организм. Причиной этого служит то, что число копий клонированного гена ограничивается одной на хромосому, иными словами, конечный выход белка невысок. Можно было бы использовать тандемные последовательности генов, но они часто оказываются нестабильными. [44]

Для направленного мутагенеза клонированных генов используют разные экспериментальные подходы. В одних случаях вносят изменения в специфические сайты клонированного гена, в других случайным образом изменяют короткий фрагмент клонированного гена и среди образующихся мутантных белков выбирают один, обладающий необходимой активностью. [45]

Страницы: 1 2 3 4