Клонированный ген
Cтраница 4
Клонирующий вектор несет участок Т - ДНК, содержащий клонированный ген. После введения в клетку Agrobacterium он подвергается гомологичной рекомбинации с резидентной разоруженной ( неонко-генной) Ti-плазмидой с образованием одной плазмиды, несущей генетическую информацию, необходимую для переноса генетически измененной области Т - ДНК в растительную клетку. [46]
Если штамм содержит неактивную гидрогеназу, его способность фиксировать азот и стимулировать рост растения уменьшается. С учетом всего сказанного выше были предприняты попытки ввести клонированные гены гидрогеназ в штаммы Rhizobium, вступающие в симбиотические отношения с сельскохозяйственными культурами. [47]
ВКО имеет широкий спектр хозяев ( позвоночных и беспозвоночных), остается жизнеспособным в течение многих лет после лиофи-лизации ( испарения воды с помощью замораживания) и не обладает онкогенными свойствами, а потому может использоваться для создания так называемых векторных вакцин. С их помощью осуществляется доставка и экспрессия в организме-хозяине клонированных генов, кодирующих антигенные белки, которые индуцируют выработку протективных антител. Геном ВКО имеет большие размеры и не содержит уникальных сайтов рестрикции, что не позволяет встраивать в него дополнительные нуклеотидные последовательности. [49]
В экспрессирующие векторы млекопитающих уже встроены гены самых разных белков и осуществлена их экспрессия в хозяйских клетках. Иногда выход продукта увеличивался, если между промотором и клонированным геном встраивали интрон. Механизм этого феномена неизвестен. Возможно, первичный транскрипт клонированного гена содержит скрытые сайты сплайсинга, по которым вырезается часть кодирующей области клонированного гена, а при наличии дополнительного интрона сплайсинг по ним происходит с меньшей вероятностью. [51]
Трансформантов отбирают по признаку устойчивости к ампициллину и чувствительности к тетрациклину. Примерно 90 % из них содержат специфическую мутацию в клонированном гене. У остальных трансформантов клонированный ген не был изменен либо потому, что олигонуклеотид не гибридизо-вался с ним, либо потому, что он вытеснялся в ходе синтеза ДНК. Клетки, несущие мутантный клонированный ген, идентифицируют с помощью гибридизации. Все плазмиды, штаммы, ферменты, олигонуклеотиды ( кроме того, который предназначен для изменения клонированного гена), а также буферы продаются в наборе, что облегчает работу. [52]
Эффективность синтеза белка зависит от наличия в его мРНК специфических нуклеотид-ных последовательностей. Чтобы предотвратить разрушение белкового продукта или обеспечить его секрецию, клонированные гены, которые кодируют этот белок, подвергают направленным изменениям. [53]
Для этого, например, ген DHFR встраивали поблизости от клонированного гена, так чтобы оба гена находились под контролем одного промотора и имели общий сигнал полиадени-лирования, а ген DHFR был фланкирован сайтами сплайсинга интрона. [55]
Для ее решения нужно научиться контролировать экспрессию таким образом, чтобы клонированный ген экспрессировался только в определенной фазе клеточного цикла и только в течение определенного времени, а для этого нужно использовать сильные регулируемые промоторы. Плаз-миды, сконструированные для этих целей, называются экспрессирующими векторами. [57]
Культуру клеток насекомого, трансфициро-ванную ДНК AcMNPV, трансфицируют затем транспортным вектором, несущим клонированный ген. В некоторых дважды трансфицирован-ных клетках происходит двойной кроссинговер, в результате которого клонированный ген вместе с промотором и сигналом терминации транскрипции гена полиэдрина встраивается в ДНК AcMNPV ( рис. 7.9), замещая ген полиэдрина. Вирионы, не содержащие этого гена, образуют зоны клеточного лизиса, из которых можно выделить рекомбинантный бакуловирус. [58]
Страницы: 1 2 3 4