Гибридом

Cтраница 1

ПЦР-амплификация CDRl-участка, входящего в состав кДНК L-цепи моноклонального антитела грызуна. Олигонуклеотидные праймеры Р1 и Р2 комплементарны последовательностям ДНК CDRl-участка антитела грызуна. Кроме того, каждый праймер содержит на 5 -конце 12 нуклеотидов, комплементарных каркасным участкам ( framework region, FR кДНК L-цепи антитела человека. Используя шесть пар олигонуклеотид-ных праймеров - три для VL - и три для Ун-областей, - с помощью ПЦР амплифицировали отдельно каждый из ДНК-сегментов, кодирующих CDR-участки антитела грызуна. Затем, используя олигонуклеотид-направлен-ный мутагенез, заменили ими соответствующие сегменты генов антитела человека. Такая замена оказалась возможной благодаря тому, что амплифицированные фрагменты содержали участки, комплементарные каркасным областям гена антитела человека. [1]

Гибридомы, подобно большинству других клеточных культур животных, растут относительно медленно, не достигают высокой плотности и требуют сложных и дорогих сред. Получаемые таким образом моноклональные антитела очень дороги, что не позволяет широко использовать их в клинике. Чтобы решить эту проблему, были предприняты попытки создания своего рода биореакторов на основе генетически модифицированных бактерий, растений и животных. [2]

Гибридома ( Hybridoma) Гибридная клеточная линия, полученная при слиянии нормальных антителообразу-ющих клеток ( лимфоцитов) и миеломных клеток. Обладает способностью к неограниченному росту и синтезу моноклональных антител. [3]

Клетки гибридомы культивируют в течение 4 - 5 дней без смены среды. Надосадок, содержащий моноклональные антитела, собирают и используют для их получения. Клетки суспендируют в свежей ростовой среде и культивируют таким же способом. Концентрируют полученную культуральную жидкость ( NH4hS04 ( с. [4]

Накануне замораживания заменяют среду, в которой культивируются гибридомы, на свежую. Клетки замораживают только в экспоненциальной стадии роста. [5]

Схематичное изображение генов к - и Н - цепей иммуноглобулинов человека. А. Строение гена к-цепи иммуноглобулина в клетках зародышевой линии. Штриховая линия - промежуточные домены, здесь не показанные. Ген функциональной к-цепи, например Ук8 - 1к4 - Ск, образуется в В-клетках в результате нескольких перестроек соответствующих ДНК-доменов. Представленная здесь комбинация - лишь одна из 500 возможных. Б. Строение гена Н - цепи иммуноглобулина в клетках зародышевой линии. Штриховая линия - промежуточные домены, здесь не показанные. Ген функциональной Н - цепи, например VH33 - DH26 - JH4 - Coc, образуется в В-клетках в результате ряда перестроек соответствующих доменов. Представленная здесь комбинация - лишь одна из 140 000 возможных. На рисунке показан только один Су-домен, хотя на самом деле их четыре ( Cyl, Су2а, Су2Ь и СуЗ. [6]

Их иммунизировали тремя разными антигенами, и в каждом случае гибридомы секретировали человеческие моно-клональные антитела, обладающие высоким сродством к антигену, которым животные были иммунизированы. Весьма вероятно, что с помощью такой трансгенной системы удастся получать человеческие моноклональные антитела для использования их в медицине. [7]

Линии некоторых миеломных клеток, рекомендованные для получения гибридом. [8]

Образование гомо ( ди -, поли) кариртической клетки является лишь первой ступенью к возникновению гибридомы. В последующем, после первого митоза, ядра сливаются и образуются синка-риотические гибридные клетки. Однако замечено, что лишь гибридомы с неслившимися ядрами могут развиваться дальше. Если родительские партнеры при этом различались по фенотипу, то соматический гибрид имеет смешанный фенотип. [9]

Трансгенные мыши с таким набором генов антител человека синтезировали человеческие антитела к некоторым антигенам; кроме того, были созданы гибридомы, продуцирующие человеческие моноклональные антитела. Однако разнообразие человеческих антител, продуцируемых такими трансгенными мышами, было невелико вследствие ограниченности набора вариабельных сегментов Н - и к-цепей. Чтобы решить эту проблему, создали YAC с большим числом генов вариабельных участков Н - и к-цепей гемоглобина человека. [10]

Более того, возможно и соединение лучших качеств двух разных клеток в одной, так называемой гибридной клетке, или гибридоме. Гибридома обладала уникальными свойствами, она долго жила и продуцировала чистые антитела. [11]

Полученное методом генной инженерии антитело, сходное по своей структуре с антителом человека. Сегменты ДНК, кодирующие CDR-участки ( CDR1, CDR2 и CDR3 антитела человека, заменены на последовательности, кодирующие CDR-участки Н - и L-цепей иммуноглобулина мыши. Продуктом этого рекомбинантного гена является иммуноглобулин с анти-генсвязывающей специфичностью моноклинального антитела мыши ( участки, выделенные розовым цветом и остальными свойствами антитела человека ( участки, выделенные голубым цветом. [12]

Моноклональные антитела грызунов, сходные с антителами человека, можно получить, выделив кДНК L - и Н - цепей из клеточной линии гибридомы грызунов и амплифицировав их вариабельные области с помощью ГЩР. В качестве праймеров для амплификации можно использовать олигонуклеотиды, комплементарные высококонсервативным сегментам ДНК, фланкирующим с 5 - и 3 -концов последовательность, кодирующую вариабельную область. Зная нук-леотидные последовательности кДНК вариабельных областей легкой и тяжелой цепей ( VL и VH), легко определить границы CDR, основываясь на том, что соответствующие им последовательности гипервариабельны, в то время как каркасные области относительно консервативны. [13]

Клетки селезенки не обладают таким генетическим дефектом и поэтому миеломные клетки, не синтезирующие нуклеотиды, через определенноеиремя исчезают из культуры. Гибридомы остаются единственными делящимися клетками. Среду сменяют каждые сутки в течение двух дней, а затем - один раз через 48 часов. Примерно через 2 недели гибридомы начинают активно расти. [14]

Страницы: 1 2