Гибридом
Cтраница 2
 |
Использование моноклональных антител для выявления различных соединений и диагностики инфекционных заболеваний. [16] |
После культивирования полученных клонов среды вновь тестируют, определяя, какая из клеточных линий ( гибридом) продуцирует мо-ноклональные антитела, распознающие антиген-мишень. В том случае, когда получают более одной специфичной гибридомы, проводят дальнейшие исследования, позволяющие определить, направлены ли антитела, вырабатываемые разными клонами, против одной и той же антигенной детерминанты. Каждый клон, продуцирующий моноклопальное антитело, можно поддерживать в культуре практически бесконечно. [17]
Келе-ром) биотехнологию получения моноклональ-ных антител, секретируемых клеточными гибридами - гибридомами. [18]
Келе-ром) биотехнологию получения моноклоналъ-ных антител, секретируемых клеточными гибридами - гибридомами. [19]
Из чашек Петри с фидерными клетками пастеровской пипеткой полностью отбирают среду, в чашки заливают агар и оставляют до застывания агара. К подготовленным клеточным суспензиям добавляют по 4 мл агара и разливают в чашки Петри с предварительно застывшим агаром. Для каждой гибридомы получают по две чашки Петри с концентрацией клеток, различающейся в два раза. Чашки тавят во влажный СО2 - инкубатор с 5 % СО2 при 37 С. В течение 1 - 2 нед в чашках Петри появляются колонии клеток, видимые невооруженным глазом как белые пятнышки. [20]
Образование гомо ( ди -, поли) кариртической клетки является лишь первой ступенью к возникновению гибридомы. В последующем, после первого митоза, ядра сливаются и образуются синка-риотические гибридные клетки. Однако замечено, что лишь гибридомы с неслившимися ядрами могут развиваться дальше. Если родительские партнеры при этом различались по фенотипу, то соматический гибрид имеет смешанный фенотип. [21]
Через 10 - 14 дней проверяют микропланшеты на появление клонов гибридом и заменяют среду ГАТ на среду ГТ, которую заменяют на свежую каждые 3 дня до тех пор, пока выросшие клетки не займут 1 / 4 площади лунок. Затем переходят на ГС, которую также заменяют на свежую каждые 2 - 3 дня. Когда клетки займут 1 / 3 площади лунок, гибридомы тестируют на специфичность методом ИФА ( с. Специфичные гибридомы реклонируют в полужидком агаре и далее - методом предельных разведений. [22]
Через 10 - 14 дней проверяют микропланшеты на появление клонов гибридом и заменяют среду ГАТ на среду ГТ, которую заменяют на свежую каждые 3 дня до тех пор, пока выросшие клетки не займут 1 / 4 площади лунок. Затем переходят на ГС, которую также заменяют на свежую каждые 2 - 3 дня. Когда клетки займут 1 / 3 площади лунок, гибридомы тестируют на специфичность методом ИФА ( с. Специфичные гибридомы реклонируют в полужидком агаре и далее - методом предельных разведений. [23]
Клетки селезенки не обладают таким генетическим дефектом и поэтому миеломные клетки, не синтезирующие нуклеотиды, через определенноеиремя исчезают из культуры. Гибридомы остаются единственными делящимися клетками. Среду сменяют каждые сутки в течение двух дней, а затем - один раз через 48 часов. Примерно через 2 недели гибридомы начинают активно расти. [24]
Как уже говорилось, у таких больных в результате присутствия одного злокачественно разросшегося клона В-лимфоцитов вырабатывается огромное количество индивидуального иммуноглобулина, который сравнительно лещо отделить от всех остальных. Дальнейшие успехи в получении индивидуальных антител связаны с достижениями клеточной биологии, позволившими осуществлять слияние клеток миеломы как носителей способности к неограниченному размножению с нормальными В-лимфоцитами как носителями программы для выработки антител определенной, задаваемой экспериментатором специфичности. Получающиеся клетки, гибрид о ми сохраняют способность к неограниченному размножению и вырабатывают индивидуальные антитела. Так как в этом случае гибридомы происходят от одной исходной слитной клетки, то они представляют собой единый клон; получающиеся из них антитела называют поэтому моноклопалъными антителами. [25]
Микропланшеты ставят во влажный СО2 - инкубатор с 5 % СО2 при 37 С. Каждый 96-луночный планшет делят на две части и в каждые 48 лунок распределяют одну и другую клеточные суспензии одного клона гибридомы. Помещают микропланшеты в СО2 - инкубатор. Через 10 - 14 дней проверяют рост колоний в микропланшетах и отбирают те, в которых колонии выросли в менее 30 % лунок. Культуральные жидкости из этих лунок тестируют методом ИФА ( с. Клетки из лунок, давших положительные реакции, последовательно наращивают в 96 -, 24-луночных чашках и культуральных матрасах. [26]
Антитела составляют фракцию гамма-глобулинов сыворотки крови, называемую еще иммуноглобулинами. Получение чистых антител из иммуноглобу-линовой фракции до недавнего времени было труднодоступно. Однако в 1975 г. Милыптейн и Коллер сделали важное открытие, установив, что В-клетки, продуцирующие только один вид антител, могут сливаться с клетками миеломы. В то время как В-клетки не могут быть выращены в виде культуры, клетки миеломы в культуре растут и размножаются. Среди образующихся в результате слияния гибридных клеток, называемых гибридомами, обнаруживаются клетки, сохранившие способность образовывать те же самые антитела, что и В-клетки, использовавшиеся для получения гибридом. В то же время эти гибридомы сохраняют бессмертный характер миеломных клеток. Таким образом, было осуществлено клонирование гибридомных клеток, полученных на основе В-клеток, способных синтезировать определенный вид антител, что дало возможность получать неограниченное количество таких антител. [27]
Антитела составляют фракцию гамма-глобулинов сыворотки крови, называемую еще иммуноглобулинами. Получение чистых антител из иммуноглобу-линовой фракции до недавнего времени было труднодоступно. Однако в 1975 г. Милыптейн и Коллер сделали важное открытие, установив, что В-клетки, продуцирующие только один вид антител, могут сливаться с клетками миеломы. В то время как В-клетки не могут быть выращены в виде культуры, клетки миеломы в культуре растут и размножаются. Среди образующихся в результате слияния гибридных клеток, называемых гибридомами, обнаруживаются клетки, сохранившие способность образовывать те же самые антитела, что и В-клетки, использовавшиеся для получения гибридом. В то же время эти гибридомы сохраняют бессмертный характер миеломных клеток. Таким образом, было осуществлено клонирование гибридомных клеток, полученных на основе В-клеток, способных синтезировать определенный вид антител, что дало возможность получать неограниченное количество таких антител. [28]
В иммуноферментном анализе используются поли - и моноклональ-ные антитела как по отдельности, так и вместе. Относительная легкость получения поликлональных антител из антисывороток иммунизированных животных в ряде случаев дает возможность пренебречь их гетерогенностью. Однако разработка метода получения монокло-нальных антител - продуктов гибридных клеток - дала им огромные преимущества в иммунохимическом анализе в связи с уникальными свойствами, выгодно отличающими их от антисывороток. Использование моноклональных антител в иммуноферментном анализе дает возможность работать с практически неограниченным источником антител, однородных по молекулярным и иммунологическим свойствам. Это связано с тем, что моноклональные антитела, продуцируемые гибридомами, связываются со специфическим участком на поверхности белковой молекулы - антигенной детерминантой и могут быть использованы в качестве селективных зондов на определенные структурные участки. [29]
В 1970 - х годах Цезарь Милыптейн ( С. До того времени антитела выделяли из крови животных, которых специально подвергали действию нужного антигена. Однако конечный продукт получался недостаточно чистым и содержал сотни различных антител. Мильштейн и Келер решили проблему, разработав методику получения моноклональных антител, за которую в 1984 г. они были удостоены Нобелевской премии. Мо-ноклональный означает принадлежащий одному клону. Каждый тип антител продуцируется одним типом В-клеток, которые клонируют сами себя, другими словами, размножаются, образуя много идентичных копий самих себя в ответ на определенный антиген. Теоретически можно выделить и культивировать определенный тип В-клеток и получить большое количество чистых антител одного типа. Поскольку все антитела, полученные таким путем, происходят от одного клона, они называются моноклональными. Однако в культуральной среде В-клетки могут поддерживаться лишь несколько дней. Мильштейн и Келер путем слияния В-клеток с раковыми клетками, которые являются бессмертными, получили клетки гибридомы. Эти клетки продолжают размножаться и могут быть клонированы, что позволяет получать большое количество антител. [30]
Страницы: 1 2