Cтраница 2
Существует четыре метода определения N-концевых аминокислот. Первый из них основан на арилировании полипептида 1-фтор - 2 4-динитробензо-лом ( уравнение III.3) с образованием 2 4-дшштрофенильного производного N-концевого остатка. Полный гидролиз белка, экстракция ДНФ-аминокис-лоты органическими растворителями и хроматографирование или какое-нибудь другое определение модифицированной аминокислоты позволяют затем установить природу N-концевого остатка. [16]
Получаемые при таком гидролизе смеси высокомолекулярных осколков были настолько неоднородны, что попытки разделить их не могли увенчаться успехом. Фишер ( в соответствии со своими представлениями о построении белков из низкомолекулярных веществ) полагал, что имеет смысл осуществить только полный гидролиз белков, но не столь глубокий, чтобы конечные продукты распада могли претерпевать какие-либо существенные изменения. Данные, свидетельствующие о том, что по крайней мере некоторые аминокислоты включаются в белки в оптически активном состоянии, позволили использовать сохранение оптически активных конечных продуктов в качестве критерия осторожности гидролиза. Щелочной гидролиз, приводящий к рацемизации, применялся Фишером весьма редко. [17]
Окончательно проблема была решена с помощью масс-спектро-метрии ацетилированного и перметилированного тетрапептида. Установлено, что каждый остаток глутаминовой кислоты содержал дополнительную карбоксильную группу и, согласно данным ЯМР, последняя должна находиться на у-углеродном атоме. Поскольку этот остаток представляет собой 1 1-дикарбоновую кислоту, во время кислотного гидролиза перед аминокислотным анализом происходило его декарбоксилирование. Удивительно, в виду такого долгого поиска этой таинственной аминокислоты, что для полного гидролиза белка не была использована смесь протеоли-тических ферментов ( см. разд. Белки системы свертывания крови, отличные от протромбина, связывают Са2, что является обязательной стадией в нормальном механизме биоактивации. [18]
Гидролиз белков 3Af / г-толуолсульфокислотой или 4М метан-сульфокислотой [7,8], содержащей 0 2 % триптамина, в вакууме при 110 С, в течение 3 суток с хорошим выходом приводит к аминокислотам, включая триптофан, однако углеводы могут мешать. Триптофан можно определять также после щелочного гидролиза, но при этом разрушаются полностью аргинин, цист ( е) ин, серии и треонин. Общее содержание амидов, обусловленное наличием аспарагина и глутамина, можно определить после гидролиза 10 М НС1 при 37 С в течение 10 суток и последующего анализа на аммиак с помощью микродиффузионной техники. Раздельное определение аспарагина и глутамина можно провести с помощью предварительной этерификации ( метанол-уксусный ангидрид) свободных карбоксильных групп, последующего восстановления ( борогидрид лития) образовавшихся сложноэфирных групп и определения аспарагиновой и глутаминовой кислоты после кислотного гидролиза соответственно в виде у-гидрокси-ос-аминомасляной кислоты и б-гидрдкси-а-аминовалериановой кислоты. Содержание аспарагина и глутамина получают путем вычитания этих величин из содержания аспарагиновой и глутаминовой кислот после полного гидролиза немодифицированного белка. [19]