Щелочной гидролизат
Cтраница 2
 |
Установка для гидролиза аланапа и отгонки образующегося о-нафтиламина. [16] |
В результате щелочного гидролиза из гербицида образуется а-нафтиламин. Перегонка с паром обеспечивает полное выделение этого вещества из щелочного гидролизата. Последующее воздействие ледяной уксусной кислоты и реактива, состоящего из азо-тистокислого натрия и сульфанило-вой кислоты приводит к развитию окрашенного комплекса с максимумом поглощения в области 534 ммк. Чувствительность определения составляет 2 мкг аланапа. [17]
В кислотном гидролизате Три определить нельзя, так как при этом он полностью разлагается. В принципе существуют 2 методики определения Три: специфическая качественная цветная реакция в щелочном гидролизате и спектрофотометрия Три в исходном растворе. Обе методики имеют свои недостатки: цветная реакция в щелочном гидролизате не строго специфична, так как гидролизат содержит много примесей, а спектрофотометрическии способ применим только тогда, когда вещество полностью растворяется, образуя прозрачный. [18]
Аликвотную часть ( 10 - 25 мкл) этого раствора, содержащую 0 8 - 1 5 мкг нуклеотидов в 1 мкл, наносят на пластинку с ПЭИ-целлюлозой. Скорость перемещения компонентов щелочного гидролизата РНК уменьшается в следующем порядке: нуклеозиды ( 2 / - 3 - ЦМФ 2 - АМФ3 - АМФ ( 2 - 3 - УМФ) ( 2 - 3 - ГМФ) дифосфаты. Тот же порядок элюирования сохраняется для 5 -изомеров и соответствующих производных, содержащих дезоксирибозу. Особенно четко разделяются компоненты щелочных гидролизатов РНК при восходящей непрерывной тонкослойной хроматографии на ПЭИ-целлюлозе. Для этой цели используют пластинки длиной 17 см, к верхнему краю которых прикреплен фитиль длиной 10 см из бумаги Ватман 3 ММ. Общая продолжительность хроматографии составляет 4 час. Количественное определение веществ на пластинках производят прямым методом ( см. разд. [19]
 |
А. Передняя правая конечность, старая лапка направлена. [20] |
Описываемые нами опыты с продуктами глубокого расщепления хряща, проведенные на почти взрослых аксолотлях ( 6-месячных), дали поразительные результаты. В опыте с солянокислым гидролизатом при вложении четырем аксолотлям получено по одному хорошо развитому новообразованию у каждого аксолотля. Что касается опытов с щелочным гидролизатом, характеризующимся примерно той же степенью распада хряща, что и в опыте с 1 % - ной соляной кислотой, то в результате вложений никаких новообразований не было получено. Невидимому, при длительном воздействии щелочи на ткань и ее продукты распада происходит разрушение или рацемизация активных веществ, стимулирующих процесс роста и появления новообразований. [21]
Современная фаза развития химии нуклеиновой кислоты основывается на разработке подходящих методов фосфорилирования, которые позволяют получать все теоретически возможные простые нуклеотиды и изучать их химические свойства, а также на применении ионообменной хроматографии для исследования гидролизатов нуклеиновых кислот, что позволяет выделять все присутствующие в них простые нуклеотиды. До 1949 г. считалось, что щелочной гидролиз рибонуклеиновых кислот приводит к образованию четырех простых нуклеотидов, которые на основании данных Ливена ( сомнительных в настоящее время) рассматривались как 3 -фосфаты четырех нуклеозидов-аденина, гуанозина, уридина и цитидина. Кон 15 ], подвергнув щелочные гидролизаты рибонуклеиновых кислот ионообменной хроматографии, показал, что эти гидролизаты содержат не четыре, а восемь простых нуклеотидов, образующих четыре пары изомерных а - и i-нуклеотидов, соответствующих каждому из четырех нуклеотидов. В это же время был разработан ряд новых методов фосфорилирования, что открыло путь для сгштеза простых нуклеотидов. Удалось успешно осуществить не вызывающий сомнений синтез рибонуклеозид-5 - фосфатов [6], однако синтез 2 - и З - фосфатов, который бы позволил установить положение фосфорных остатков, оказался на некоторое время невозможным как вследствие стерических трудностей, так и в результате миграции фосфорного остатка. Однако Брауну н Тодду 17 ] удалось осуществить синтез аденозин-2 - и аденозин-3 - фосфатов фосфорилированпем 5 -тритиладенозипа и разделить смесь продуктов реакции при помощи ионообменной хроматографии. Выделенные вещества оказались идентичными а-и i-адопнловым кислотам Картера и Копа, однако было по ясно, какое из этих соединений является: 2 -, а какое З - изомером. Хотя общая теория структуры нуклеиновых кислот фактически была выдвинута до того, как была решена проблема структуры 2 - и З - фосфатов, в настоящее время при помощи физических 81 и химических [9] методов установлено, что а-нуклеотиды являются 2 -, а 6-нуклеотиды З - фосфатамн соответствующих нуклеозидов. [22]
В кислотном гидролизате Три определить нельзя, так как при этом он полностью разлагается. В принципе существуют 2 методики определения Три: специфическая качественная цветная реакция в щелочном гидролизате и спектрофотометрия Три в исходном растворе. Обе методики имеют свои недостатки: цветная реакция в щелочном гидролизате не строго специфична, так как гидролизат содержит много примесей, а спектрофотометрическии способ применим только тогда, когда вещество полностью растворяется, образуя прозрачный. [23]
Поэтому возможно образование трех нуклеозидмонофосфатов. Так, из аденозина могут получиться 3 монофосфата ( 3 адениловые кислоты) - аденозин-5 - фосфат, аде-нозин - З - фосфат и аденозин-2 - фосфат. Первое из этих соединений, обнаруженное в свободном состоянии впервые в мышцах, было названо мышечной адениловой кислотой; второе вещество, впервые полученное из щелочного гидролизата дрожжевой РНК, получило название дрожжевой адениловой кислоты. [24]
Аликвотную часть ( 10 - 25 мкл) этого раствора, содержащую 0 8 - 1 5 мкг нуклеотидов в 1 мкл, наносят на пластинку с ПЭИ-целлюлозой. Скорость перемещения компонентов щелочного гидролизата РНК уменьшается в следующем порядке: нуклеозиды ( 2 / - 3 - ЦМФ 2 - АМФ3 - АМФ ( 2 - 3 - УМФ) ( 2 - 3 - ГМФ) дифосфаты. Тот же порядок элюирования сохраняется для 5 -изомеров и соответствующих производных, содержащих дезоксирибозу. Особенно четко разделяются компоненты щелочных гидролизатов РНК при восходящей непрерывной тонкослойной хроматографии на ПЭИ-целлюлозе. Для этой цели используют пластинки длиной 17 см, к верхнему краю которых прикреплен фитиль длиной 10 см из бумаги Ватман 3 ММ. Общая продолжительность хроматографии составляет 4 час. Количественное определение веществ на пластинках производят прямым методом ( см. разд. [25]
Последовательность оснований в олигонуклеоти-дах из Т - - РНК-азного гидролизата чаще всего устанавливают при помощи гидролиза щелочью или панкреатической РНК-азой или же частичным гидролизом фосфодиэстеразой селезенки. Аналогично структуру олигонуклеотидов из панкреатического РНК-азного гидролизата можно определить, проводя гидролиз щелочью или Т1 - РНК-азой или же частичным гидролизом фосфодиэстеразой селезенки. Все опыты выполняют в микромасштабе, в объеме 5 - 10 мкл, так что пробы можно прямо подвергать электрофорезу или хроматографии. Так, неизвестный олигонуклеотид из T - j - РНК-азного гидролизата делят на три порции: первую обрабатывают щелочью, вторую - панкреатической РНК-азой, а третью подвергают частичному гидролизу фосфодиэстеразой селезенки. Продукты щелочного гидролиза разделяют электрофорезом на бумаге ватман 54, а продукты расщепления панкреатической РНК-азой - на DEAE-бумаге. Определение нуклеотидного состава в щелочном гидролизате осуществляют простым сравнением положений радиоактивных пятен с известными положениями мононуклеотидов и определением относительной радиоактивности каждого пятна. Продукты нуклеазного гидролиза с короткой цепью часто удается идентифицировать лишь по их положению на электрофореграмме. [26]
Страницы: 1 2