Cтраница 2
Следует также упомянуть метод центрифугирования в градиенте плотности. Обычно работают в возрастающем градиенте плотности сахарозы при высокой скорости ротора. Расстояние, на которое перемещается белок в градиенте, обратно пропорционально его молекулярной массе. [16]
Полисомы отделяли путем центрифугирования в градиенте плотности сахарозы. [17]
Известное практическое значение имеет проблема эффективности градиента плотности, в котором седи-ментирует зона. Спрэгг и Рэнкин [23] определяли эффективность градиента плотности сахарозы 5 - 12 % в роторе Андерсона для исследования фага ТЗ. [18]
Хотя дифференциальное центрифугирование по предложенной схеме в некоторых случаях и обеспечивает разделение ядер и хлоропластов, обычно фракция ядер оказывается загрязненной хлоропластами и наоборот. Для лучшего разделения компонентов используют центрифугирование в градиенте плотности сахарозы. В общих чертах метод сводится к следующему. Центрифужную пробирку заполняют раствором сахарозы, так что его концентрация в пробирке плавно уменьшается в направлении снизу вверх. [19]
В какой именно мембране находится этот фермент, неясно. Его локализация в субсинап-тической области постсинаптической мембраны кажется достаточно сомнительной; во-первых, из-за высокой плотности ре-цепторных белков там недостаточно места для локализации подходящего количества фермента и, во-вторых, при субфракционировании синаптических мембран центрифугированием в градиенте плотности сахарозы ацетилхолинэстераза и ацетил-холиновый рецептор были найдены в разных мембранных фракциях. Это указывает, следовательно, на то, что ацетилхолинэстераза связана не с постсинаптической мембраной, а с ба-зальной пластинкой между пре - и постсинаптическими мембранами. Фермент имеет трехспиральный хвост и головку, образованную тремя тетрамерами. Коллагеназа осуществляет специфическое расщепление только по связям, образованным карбоксильной группой пролина, а аминокислотный анализ хвостовой части фермента свидетельствует о содержании в нем до 15 % пролина и редких аминокислот гидроксили-зина и гидроксипролина. Эти результаты указывают на колла-геноподобную структуру фермента и на его сходство с базаль-ной мембраной, ведущей свое происхождение от волокон коллагена. [20]
МЛ ( - 4) - буфера и каждую О 3 милли литровую аликвотную часть наслаивают на поверхность 4 6 мл линейного градиента плотности сахарозы ( 10 - 30 %), приготовленного в ТМА ( - 4) - буфере. Пробирки помешают в ротор SW - 39 и центрифугируют 4 ч при 36 000 об / мин и 4 С. Этот процесс проводят точно так же, как было описано выше в случае центрифугирования тРНК в градиенте плотности сахарозы. После центрифугирования градиент фракционируют через дно пробирки, по 3 капли в каждой фракции. [21]
Затем поверх градиента наслаивают гомогенат и проводят центрифугирование при больших скоростях в роторе с откидывающимися в горизонтальное положение стаканами. Хлоропласты же остаются взвешенными в слое 1 3 М сахарозы. Хотя плотности и скорости осаждения хлоропластов несколько варьируют в зависимости от вида растения, все же в большинстве случаев такое центрифугирование в градиенте плотности сахарозы позволяет полно разделить ядра и хлоропласты ( фиг. [22]
Для идентификации гена, кодирующего про-токсин, используют обычную методику. Выделяют суммарную клеточную ДНК и центрифугируют ее в градиенте плотности CsCl, чтобы разделить плазмидную и хромосомную ДНК. Если гены протоксинов входят в состав генома, создают банк клонов хромосомной ДНК. Если же они содержатся в плазмиде, то плазмидную ДНК фракционируют по размерам центрифугированием в градиенте плотности сахарозы. [23]
Одно из них - так называемая температура плавления Тт - это температура, при которой происходит распад двухцепочечного комплекса на одноцепочечные молекулы; этот процесс легко наблюдать по изменению УФ-поглощения или оптического вращения раствора ( подробнее см. в гл. Такое центрифугирование проводят обычно в растворах солей, обладающих высокой плотностью; чаще всего применяют хлорид или сульфат цезия. При длительном центрифугировании устанавливается градиент плотности раствора, а ДНК собирается в узкой зоне, где существует равновесие между центробежной силой и выталкивающей силой, которая определяется разностью плотности осаждаемого вещества и применяемого солевого раствора в данной зоне. Равновесное центрифугирование в градиенте плотности Cs C1 может служить не только аналитическим методом для характеристики препарата ДНК, но и полезным препаративным методом для разделения ДНК, различающихся по нуклеотидному составу. Подобным же образом препаративное ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы используется для разделения молекул ДНК, различающихся по скорости седиментации. [24]
Для фракционирования субъядерных систем физическими методами необходимо разрушить ядерную мембрану. При такой обработке большинство ядер разрушается, причем хроматин и ядрышко остаются в основном интактными. В обоих случаях обработка должна быть кратковременной ( 1 - 4 мин, с тем чтобы уменьшить вероятность повреждения ядрышек. Разрушение ядер облегчается, если удалить ионы Са2 цитратом. После разрушения ядер ядрышки отделяют от хроматина путем центрифугирования в градиенте плотности сахарозы или фикола. Гомогенат ядер наслаивают на 0 - 1 8 М градиент сахарозы или 5 - 25 % - ный градиент фикола и центрифугируют при 8000 об / мин ( Spinco SW 25) в течение 5 - 20 мин. Этого достаточно, для того чтобы осадить ядрышки, но недостаточно для осаждения хроматина. В этих условиях осаждается хроматин. Надосадочную жидкость, полученную после осаждения хромосом, разбавляют до более низкой плотности и центрифугируют при 105 000 g в течение 2 час для осаждения рибосом, которые обязательно содержатся в ядре. [25]