Cтраница 1
Диэстераза змеиного яда вызывает гидролиз РНК до нуклео-зид-5 - монофосфатов ( фиг. Она гидролизует также олигонуклеотиды, образующиеся в результате действия дезоксирибонуклеазы I на ДНК, приводя к образованию дезоксирибонуклеозид-5 - фосфатов ( фиг. Наличие концевых З - фосфорильных групп придает субстрату устойчивость. [1]
Неспецифическая диэстераза змеиного яда, атакует ДНК и РНК. [2]
Гидролиз под действием диэстеразы змеиного яда протекает довольно медленно, но и в этом случае образуются оба изомерных нуклеотида. В противоположность тимидин-5 - фосфату гликозидная связь в тимидин-3 5 -цик-лофосфате легко разрывается при кислотном гидролизе. [3]
Эта точка зрения подтверждается опытами с диэстеразой змеиного яда, которая последовательно освобождает 5 -дезоксирибонуклео-тиды с концов молекулы ДНК, начиная с нуклеозидного конца. Если дать метку только в виде дЦТФ, меченного по самому внутреннему атому фосфора ( дЦФ ФФ) то диэстераза змеиного яда быстро отщепит от ДНК почти все радиоактивные нуклеотиды в виде кислоторастворимых веществ, прежде чем гидролиз зайдет настолько далеко, чтобы в заметных количествах обнаружилось вещество ( фиг. Когда в ДНК вводят метку в виде Р32 - дЦМФ, то после гидролиза продукта ДНК-азой II или диэстеразой селезенки до З - дезоксирибонуклео-тидов метку обнаруживают во всех З - дезоксирибонуклеотидах. Следовательно, фермент может присоединять меченый дЦМФ к концевым дАМФ, дГМФ, дЦМФ и дТМФ ( фиг. [4]
Расщепление цепи в точке а под действием диэстеразы змеиного яда дало бы смесь нуклеозид-5 - фосфатов, из которых только АМФ был бы меченым. Щелочной гидролиз или гидролиз диэстеразой из селезенки ( в точках Ь) дал бы такую смесь нуклеозид - З - фосфатов, в которой радиоактивной была бы часть каждого из нуклеотидов. [5]
Поэтому применением комбинации щелочного гидролиза и гидролиза диэстеразой змеиного яда можно определить головное и хвостовое нуклеотидные звенья, а также установить тип полинуклеотида. [6]
Структура динуклеотидов с концевой 5 -пирофосфатной группой полностью подтверждена щелочным гидролизом или ферментативным гидролизом диэстеразой неочищенного змеиного яда, которые привели к ожидаемым продуктам. [7]
Если произвести расщепление ДНК с помощью нуклеаз ( ДНКазы I из поджелудочной железы или диэстеразы змеиного яда), то освобождаются 3 - или 5 -нуклеотиды. Эти дезоксирибонуклеотиды соединены в нуклеиновых кислотах в длинные цепи. В ДНК молекулы пентозы чередуются с молекулами фосфорной кислоты; с каждым сахаром связано одно из четырех оснований. Такая полинуклеотидная цепь не одинакова в обоих направлениях, т.е. обладает полярностью: на одном ее конце находится фосфатная группа в положении 5, а на другом-свободная гидроксильная группа в положении У. [8]
Вопреки имеющимся сообщениям, контролируемое выделение нуклеотидов из полимеров, содержащих несколько различных оснований, было бы более убедительной демонстрацией полезности метода, особенно потому, что помехи, возникающие в результате различных скоростей гидролиза участков с различной пурин-пири-мидиновой последовательностью, искажают, как следовало ожидать, точную интерпретацию. Даже высокоочищенные препараты диэстеразы змеиного яда сохраняют, по-видимому, некоторую эндонуклеазную активность. [9]
Не участвуют в межнуклеотидных связях, по-видимому, и гидроксильные группы, поскольку, по данным электрометрического титрования, эти группы не замещены. Это подтвердили Кон и Волкин [37], которые при обработке РНК диэстеразой змеиного яда получили смесь 5 -фосфатов всех 4 нуклеозидов и хромато-графически их разделили. [10]
По-видимому, упомянутые ранее устойчивые к диэстеразе олигонуклеотидные фрагменты состоят главным образом из цепочек глкжозидо-5 - оксиметил-2 - дезоксицитидиловой кислоты, несущих концевой дезоксинуклеозид-5 - фосфат, помимо глюкозидных пиримидиновых нуклеотидов. Подобным же образом освобождение глюкозидных мононуклеотидов из ДНК при совместном действии панкреатической дезоксирибону-клеазы и диэстеразы змеиного яда может происходить в результате первоначального расщепления нуклеазой, что дает олигодезокси-нуклеотиды, несущие концевой глюкозидо-5 - оксиметил-2 - дезокси-цитидин-5 - фосфат ( присоединенный к неглюкозидному нуклеотиду), и дальнейшего расщепления этих олигодезоксинуклеотидов диэсте-разой. [11]
Эта точка зрения подтверждается опытами с диэстеразой змеиного яда, которая последовательно освобождает 5 -дезоксирибонуклео-тиды с концов молекулы ДНК, начиная с нуклеозидного конца. Если дать метку только в виде дЦТФ, меченного по самому внутреннему атому фосфора ( дЦФ ФФ) то диэстераза змеиного яда быстро отщепит от ДНК почти все радиоактивные нуклеотиды в виде кислоторастворимых веществ, прежде чем гидролиз зайдет настолько далеко, чтобы в заметных количествах обнаружилось вещество ( фиг. Когда в ДНК вводят метку в виде Р32 - дЦМФ, то после гидролиза продукта ДНК-азой II или диэстеразой селезенки до З - дезоксирибонуклео-тидов метку обнаруживают во всех З - дезоксирибонуклеотидах. Следовательно, фермент может присоединять меченый дЦМФ к концевым дАМФ, дГМФ, дЦМФ и дТМФ ( фиг. [12]
Возможно, что рибонуклеозид-5 - трифосфаты являются истинными промежуточными предшественниками РНК. Такие общие ЦЦА-концевые группировки найдены в низкомолекулярных растворимых РНК, которые служат переносчиками аминокислот при биосинтезе белков. Кратковременная обработка диэстеразой змеиного яда освобождает эти концевые группы и нарушает биологическую активность. Последняя может быть восстановлена при инкубации продукта с очищенной ферментной системой и рибонуклеозид-5 - трифосфатами. Фракционированием транспортного РНК-белкового комплекса была получена частично очищенная ферментная система, которая катализирует пирофосфоролиз только трех концевых нуклеотидов в присутствии неорганического пирофосфата. Аналогичным исследованием, в котором меченый полимер гидролизовали панкреатической рибонуклеазой ( вновь с переносом Р32), было показано, что около 65 % препарата содержит пиримидин - АЦЦА-концевые группы, а 17 % содержат на акцепторном конце последовательность пиримидин - ГЦЦА. При изучении гидролизата были найдены и другие концевые последовательности, например фЗТАЦЦА ( 3 1 %), фЗ АГЦЦА ( 3 6 %), фЗ ААЦЦА ( 1 1 %), фЗ УАЦЦА ( 7 2 %) и фЗ АУЦЦА ( 1 4 %), причем всем им должны предшествовать пиримидиновые нуклеотиды. [13]
Добавление некоторого ограниченного числа нуклеотидных единиц к концу молекулы имеющегося полирибонуклеотида не может рассматриваться как полинуклеотидный синтез. Тем не менее эта реакция близка к нему, имеет большое значение и хорошо сейчас изучена. После гидролиза диэстеразой змеиного яда был получен меченый 5 - АМФ, а после щелочного гидролиза - меченые цитидин-2 - и цитидин - З - монофосфаты. [14]
Если инкубировать неочищенный клеточный экстракт со всеми четырьмя рибонуклеозидтрифосфатами, один из которых помечен С14 или Р32 по сс-фосфату, то метка включается в кислотонерастворимый недиализуемый материал. По своим физическим, химическим и ферментным свойствам он ведет себя как РНК. Он не разлагается ДНК-азой, но гидролизуется РНК-азой, диэстеразой змеиного яда и щелочью. При щелочном гидролизе обнаруживаются все четыре предполагаемых рибонуклеотида; при этом оказывается, что меченые нуклеотиды были присоединены не к концу, а внутрь молекулы РНК. [15]