Cтраница 2
Фракционирование сложной смеси на колонке, заполненной целлюлозным анионообменным материалом, обнаружило присутствие двух больших серий веществ; они были идентифицированы как линейные олигодезоксинуклеотиды ( с 3 - 5 -меж-нуклеотидными связями), содержащие концевой 5 -моноэтерифици-рованный фосфатный остаток, и гомологический ряд циклических олигонуклеотидных производных, получающихся в результате фосфорилирования концевой З - гидроксильной группы 5 -фосфат-ной группой, находящейся на другом конце олигонуклеотида. Степень внутримолекулярной циклизации уменьшается с увеличением длины цепи; так, циклического пентануклеотида образуется только небольшое количество по сравнению с линейной пентатимидиловой кислотой. Члены обоих рядов вплоть до пентануклеотида были выделены в сравнительно чистом состоянии и охарактеризованы химическими и ферментативными методами. Низкие выходы оли-гонуклеотидов объясняются частично образованием неидентифицированных нуклеотидных производных; однако хроматогра-фические методы свидетельствовали о присутствии полимеров, содержащих до одиннадцати нуклеотидов. Диэстераза змеиного яда легко расщепляет линейные полимеры до тимидин-5 - фосфата, тогда как при обработке моноэстеразой предстательной железы ( для удаления концевого 5 -фосфата) и затем диэстеразой селезенки получаются тимидин-3 - фосфат и концевой тимидин. Длина цепи определялась из отношения количества общего фосфора к количеству фосфора, образующегося при обработке полимера моноэстеразой, и из относительных количеств мононуклеотида и нуклеозида, образовавшегося при гидролизе диэстеразой ( яда или селезенки) полученного олигонуклеотида, у которого предварительно был удален концевой фосфатный остаток. Однако, поскольку даже очищенная диэстераза яда может содержать пирофосфатазу [11], очень желательно безукоризненное доказательство чистоты, гомогенности и структуры высших олигонуклеотидов. [16]
Левый конец каждой из помещенных выше схем нуклеиновых кислот обозначим как головное звено, а нуклеозидную компоненту справа - как хвостовое звено. Из рассмотрения описанных выше механизмов очевидно, что хотя при щелочном гидролизе цепь разрывается с образованием нуклеозид-2 - и нуклеозид - З - фосфатов, в случае нуклеиновой кислоты первого типа хвостовое звено появляется в виде свободного нуклеозида, второго типа - головное звено освобождается в виде нуклеозид-2 5 - и нуклеозид-3 5 -ди-фосфатов, а хвостовое звено - в виде нуклеозида, в то время как из нуклеиновой кислоты четвертого типа головное звено освобождается в виде нуклеозид-2 5 - и нуклеозид-3 5 -дифосфатов, но не образуется свободного нуклеозида. Нуклеиновая кислота третьего типа дает исключительно нуклеозид-2 - и нуклеозид-3 - фосфаты. Ферментативный гидролиз диэстеразой селезенки ( специфичной для эфиров нуклеозид - З - фосфатов) привел бы к тем же результатам. Однако при применении диэстеразы змеиного яда ( специфичной для эфиров нуклеозид-5 - фосфатов) можно получить дополнительную информацию. [17]