Исследуемый - белка
Cтраница 1
Исследуемый белок растворяют в 70 % - ном растворе муравьиной или трифторуксусной кислоты ( концентрация белка 5 - 10 мг / мл) и добавляют сухой бромциан в 30 - 200-кратном молярном избытке по отношению к содержанию метионина. После окончания инкубации реакционную смесь разводят в 10 - 15 раз водой. При этом негидролизованный белок может выпадать в осадок и удаляется центрифугированием. Смесь пептидов подвергают лиофилизации или упаривают на роторном испарителе. Как видно из схемы, в результате расщепления полипептидной цепи на С-конце образующихся пептидов находится либо остаток го-мосерина, либо гомосеринлактон. Для того чтобы перевести все С-кон-цевые аминокислоты образующихся пептидов в лактонную форму, смесь пептидов инкубируют 1 ч в трифторуксусной кислоте при 25 С. Следует иметь в виду, что лактонная форма особенно удобна при определении первичной структуры белка на твердофазном сек-венаторе. [1]
Исследуемые белки ( рибонуклеаза, лизоцим и др.) или пептиды. [2]
Исследуемый белок растворяют в фосфатном буферном растворе рН 6 0 и, добавляя свежеприготовленный раствор диэтилпи-рокарбоната в этаноле, проводят карбэтоксилирование. Рассчитанное, исходя из этого соотношения, количество диэтил-пирокарбоната разбавляют в 5 раз этанолом. После инкубации в течение 1 ч, во время которой, кроме карбэтоксилирования, происходит также разрушение избытка диэтилпирокарбоната, раствор белка необходимо обессолить гель-фильтрацией или диализом. [3]
Исследуемый белок гидролизуют трипсином и гидролизат подвергают электрофорезу на бумаге. Ориентируясь по контрольной полоске, вырезают полоску для аналитического диагонального электрофореза и осторожно опрыскивают ее карбоксипептидазой В, растворенной в 0 1 % - ном бикарбонате аммония. Опрысканную полоску на 1 ч помещают в эксикатор, содержащий воду, при 37 С. После инкубации полоску высушивают и подвергают вновь электрофорезу под прямым углом к первоначальному направлению. [4]
Исследуемый белок инкубируют в присутствии карбоксипеп-тидазы при соответствующих условиях. В ходе инкубации из смеси отбирают пробы, в которых определяют свободные аминокислоты и таким образом устанавливают С-концевую последовательность изучаемого белка или пептида. [5]
Если исследуемый белок или пептид, растворенный в концентрированной НС1, инкубировать при 37 С в течение 72 - 96 ч, то происходит их частичное разрушение. [6]
Допустим, исследуемый белок легко агрегирует. [7]
Для малеинирования исследуемый белок растворяют в 8 М мочевине, содержащей 0 1 М пирофосфата, до концентрации 10 мг / мл. В этот раствор вносят одну каплю фенолфталеина и в три приема добавляют 30 молярных эквивалентов чистого малеинового ангидрида ( в расчете на количество аминогрупп), тщательно перемешивая раствор. Непрерывно подавая 10 % - ный раствор NaOH, рН этой смеси постоянно поддерживают в зоне перехода окраски фенолфталеина. [8]
Предположим, что исследуемый белок имеет последовательность, представленную на схеме. [9]
После построения калибровочного графика на колонку наносят исследуемый белок и, определив объем элюции, находят по графику его молекулярную массу. [10]
Анализ с помощью метода изотопного разбавления позволяет избежать полного количественного разделения компонентов смеси. Исследуемый белок подвергают гидролизу, после чего в полученный раствор добавляют известное количество одной из аминокислот, предварительно меченной радиоактивным углеродом. В растворе меченая аминокислота равномерно смешивается с аналогичной немеченой кислотой белка, после чего проводится частичное выделение из раствора исследуемой аминокислоты. Определив активность и массу выделенной порции аминокислоты по формуле (6.13), рассчитывают содержание данной аминокислоты в белке. [11]
Необходимо найти объект со сравнительно высоким содержанием нужного белка. Если исследуемый белок обладает какой-либо биологической активностью, которую можно точно оценить, то содержание его часто удается определить непосредственно в неочищенных смесях и подобрать таким образом наиболее подходящий исходный материал. Такие предварительные опыты очень важны, поскольку содержание белков в разных тканях сильно варьирует. [12]
 |
Схема сайт-специфичного мутагенеза. [13] |
Это достигается путем замены соответствующего кодона в гене, программирующем исследуемый белок. Такая процедура называется сайт-специфичным мутагенезом. [14]
Обычный метод определения аминокислот заключается в их реакции с нингидрином, которая дает интенсивно окрашенное голубое соединение, поглощение которого можно измерять при 575 нм. Этот метод используется в некоторых серийных анализаторах аминокислот, в которых исследуемые белки гидролизуются с образованием аминокислот, которые в свою очередь разделяются и измеряются спектрофо-тометрически. [15]
Страницы: 1 2