Cтраница 4
После инициации начинается продвижение репликативных вилок - элонгация. Одна из цепей вновь синтезируемой ДНК удлиняется в том же направлении, а котором движется репликативная вилка, причем синтез осуществляется непрерывно. Эту цепь ДНК называют лидирующей. Синтез каждого фрагмента инициируется вблизи начала репликационной вилки и продолжается в противоположную от нее сторону до тех пор, пока З - конец вновь синтезируемой ДНК не достигнет 5 -конца предыдущего фрагмента Оказаки. Длины фрагментов Оказаки равны примерно 1000 нуклеоти-доа. В репликативной вилке работают также еще два белка. Один из них ( SSb белок) специфически связывает одноцепочечные ДНК, облегчая расплетение двойной спирали и одновременно защищая одно цепочечные участки от действия нуклеаз. Другой - ДНК-рас-плетающий белок ( хеликазы) - движется вдоль двойной цепи. [46]
Локализация сайтов модификации в нуклеиновых кислотах обычно проводится методом, сходным с тем, который применяется при секвенированип ДНК методом Максама-Гилберта. Нуклеиновая кислота ( мишень) метится 32Р по одному из концов. После аффинной модификации реакциопноепоеобпым производным антисмыслового олигонуклеотида мишень обрабатывают так, чтобы разрушить межнуклеотидную связь в модифицированном сайте. На радиоавтографе, полученном после электрофоретического разделения, появляются полосы, соответствующие фрагментам мишени, расположенным между 32Р - мечеиным концом и точкой расщепления. Положение полосы соответствует длине фрагмента и, следовательно, указывает на расстояние между точкой расщепления и меченым концом и тем самым указывает на положение модифицированного остатка. В качестве примера на рис. 95 представлены, результаты аффинного алкнлированпя одноцепочечиой ДНК, состоящей из 303 нуклеотидов. [47]
Разрушенная двуспиральная структура в определенных условиях может быть восстановлена, по крайней мере частично. Этот процесс называют ренатурацией. Ре натура ци я происходит, если раствор денатурированной ДНК выдерживать определенное время в условиях, когда двуспиральная структура стабильна. Скорость ренатурацин зависит от многих факторов, н в первую очередь от так называемой сложности ДНК, которая представляет собой число нуклеотидных пар в неповторяющихся последовательностях ДНК. Для ДНК вирусов и бактерий сложность ДНК равна числу нуклеотидных пар в геноме, поскольку в этом случае ДНК не содержит повторяющихся последовательностей достаточно большой длины. Чем выше сложность ДНК, тем медленнее идет ренатурация. Если ренатурацни подвергают не целые, а фрагментированные молекулы, то скорость ренату рации возрастает с увеличением длины фрагментов. [48]
Механизм сорбции нуклеиновых кислот и их производных на о ксиапатите, по-видимому, во многом аналогичен механизму сорб-ции кислых белков. Вместо карбоксилов во взаимодействии с ионами кальция на поверхности сорбента участвуют остатки фосфатов по-линуклеотидной цепи. Мононуклеотиды в присутствии 1 мМ фосфатного буфера задерживаются на сорбенте слабо, а основания и нуклеози-ды не задерживаются вовсе. Ди - и тринуклеотиды сорбируются гораздо прочнее; решающую роль играют здесь фосфаты. Любопытно, что сказывается не только их число, но и расположение ] Например, нуклеозидтрифосфаты сорбируются заметно прочне е7г чем тринуклеотиды. Элюцию осуществляет фосфатный буфер с концентрацией 0 12 - 0 25 М Размер высокомолекулярной нуклеиновой кислоты сказывается мало. По-видимому, достаточно отдаленные участки длинной цепи полинуклеотида благодаря их гибкости элюируются одновременно и независимо друг от друга. Самой замечательной особенностью сорбции нуклеиновых кис-лотмна оксиапатите является резко различное поведение нативных двунитевых молекул ДНК ( или РНК) и однонитевых молекул денатурированных ДНК и РНК. Однонитевые молекулы снимаются с оксиапатита элюцией 0 12 - 0 15 М фосфатным буфером, тогда как для элюции двунитевых молекул концентрацию фосфатного буфера приходится увеличивать до 0 2 - 0 25 М) Можно предположить, что решающую роль здесь играет относительная жесткость линейной конформации двунитевых молекул. Сопоставим мысленно условия десорбции относительно коротких фрагментов нативной и денатурированной ДНК, связанных по длине фрагмента с оксиапатитом, например в трех точках. Вытеснение элюентом из связи с оксиапатитом гибкой однонитевой ДНК в одной из таких точек может повлечь за собой ( в результате тепловых деформаций гибкой нити) удаление прежде участвовавшего в этой связи фосфата ДНК от фиксированного на поверхности сорбента иона кальция. [49]