Cтраница 4
Вопрос о том, что называть А-участком - лишь положение окончательного ( запертого) связывания аминоацил-т РНК, рассматривая предыдущие положения связываемой тРНК как серию последовательных перекрывающихся участков предварительного связывания, или же эбласть рибосомы, в пределах которой возможны разные промежуточные состояния связывания аминоацил-т РНК, - носит скорее терминологический характер. Ясно, что во всяком случае при переходе от фазы к азе некоторые контакты аминоацил-т РНК с рибосомой могут несколько меняться, но перераспределения на неперекрывающиеся участки нет. РНК в процессе связывания с рибосомой рассматривается в терминах единого А-участка, с разными состояниями связывания в нем. [46]
В целом ряде независимых экспериментов были получены данные о гом, что после гидролиза ГТФ и освобождения EF-TU GDP из рибосомы аминоацил-т РНК еще до стадии транспептидации оказывается апертой в А-участке. Можно строить различные гипотезы о механизме такого запирания, но его трудно представить без конформационной перестройки тРНК или рибосомы. Одна из возможных гипотез состоит в том, что в 70S рибосоме А-участок не строго фиксирован, а деформируется в процессе кодонзави-симого связывания аминоацил-т РНК путем подстройки 30S и 50S субчастиц. [47]
Процесс, ускоряемый EF-TU с ГТФ, в свою очередь, является многоступенчатым. Он должен начинаться с кодон-антикодонового узнавания. По-видимому, только когда антикодон оказывается стерически подогнанным к кодону, может начаться вхождение тРНК в А-участок. Опыты с нерасщепляемыми или медленно расщепляемыми аналогами ГТФ показали, что на этой стадии кодонза-висимого связывания аминоацил-т РНК или, точнее, тройственный комплекс Aa - tRNA EF-TU GTP обратимо ассоциирован с рибосомой, так что если распад ГТФ не очень быстр, то может установиться равновесие. [48]
Проблема специфического фактор - кодонового взаимодействия, вместо кодон-антикодонового взаимодействия, очень интересна. Поразительно, что белок тоже узнает именно триплет нуклеоти-дов, и узнавание имеет такую же высокую степень специфичности. Более того, при наличии супрессорной тРНК, комплементарной терминирующему кодону, аминоацил-т РНК и фактор терминации равноправно конкурируют за посадку в А-участок рибосомы. Безусловно, структура белкового антико-дона представляет собой очень интригующую и важную задачу, в том числе для решения общих проблем белок-нуклеинового узнавания. [49]
РНК в А-участке реагирует с пептидил-т РНК в Р - участке, что осуществляется перенос С-конца пептида на аминоацил-т РНК. Ьперь удлиненная пептидил-т РНК ( точнее ее остаток тРНК) занимает g - участок, а образовавшаяся деацилированная тРНК - Р - участок. На стари III рибосома взаимодействует с EF-G и ГТФ, которые катализируют рремещение пептидил-т РНК ( ее остатка тРНК) вместе с кодоном мат-рцы из А-участка в Р - участок и освобождение деацилированной тРНК 3 Р - участка в раствор. По завершении этого ГТФ гидролизуется, и Е - О, ГДФ и ортофосфат освобождаются из рибосомы. В результате Снова достигается состояние, когда пептидил-т РНК находится в ручастке, а в А-участке установлен следующий кодон матрицы, и он IJQTOB воспринять следующую аминоацил-т РНК. Трансляция всей коди-ующей последовательности матричного полинуклеотида и элонгация рлипептида на рибосоме осуществляются повторением именно таких JHUIOB. Кстати, стадия инициации и стадия терминации трансляции редставляют собой не более, чем модификации представленного здесь бочего элонгационного цикла - см. гл. [50]
Уже говорилось, что факторы терминации узнают терминирующий кодон, установленный именно в А-участке рибосомы. Прежде всего, кодонзависимое связывание RF возможно только после транслокации пептидил-т РНК из А-участка в Р - участок. В экспериментах in vitro можно прямо связать триплет AUG и инициатор-ную F-Met - tRNA с Р - участком вакантной рибосомы, а затем добавить RF и триплет UAA ( или UAG, или UGA); последние связываются и индуцируют гидролиз F-Met - tRNA в Р - участке с освобождением свободного формилметионина. Довольно очевидно, что в указанном случае терминирующий триплет и RF попадают в вакантный А-участок. Тот факт, что супрессорная аминоацил-т РНК с EF-TU и ГТФ, несущая антикодон, комплементарный терминирующему кодону, конкурирует с RF в процессе трансляции, тоже говорит об А-участке как месте связывания RF. Такие ингибиторы А-участка рибосомы, как тетрациклин и стрептомицин, ингибируют кодонзависимое связывание факторов терминации с рибосомой. EF-G, стабильно связанный с рибосомой ( например, в присутствии фусидовой кислоты), мешает как связыванию комплекса Aa - tRNA EF-TU GTP, так и RF с рибосомой. Белок прокариотической рибосомы L7 / L12, образующий боковой стержень на 50S субчастице, способствует как связыванию факторов элонгации, так и RF. Данные по ингибированию кодонзависимого связывания RF антителами к индивидуальным рибосомным белкам подтверждают, что место связывания RF сильно перекрывается одновременно с А-участком и участком связывания факторов элонгации. [51]
На третьей стадии инициации этот большой комплекс взаимодействует с 508-рибосомной субчастицей; одновременно молекула GTP, связанная с IF-2, гидролизуется до GDP и фосфата, которые высвобождаются из комплекса. Факторы инициации IF-3 и IF-2 также покидают рибосому. Правильное положение N-фор-милметионил - тРНКШе в полном 708-инициирующем комплексе обеспечивается двумя точками узнавания и связывания. Во-вторых, инициирующая аминоацил-т РНК присоединяется к пептидильному Р - участку рибосомы. В рибосоме имеется два участка связывания аминоацил-т РНК: аминоацил -, или А-участок и пептидил -, или Р - участок. Оба они образованы благодаря специфическому сочетанию областей 30S - и 508-субчастиц. [52]
Уже говорилось, что факторы терминации узнают терминирующий кодон, установленный именно в А-участке рибосомы. Прежде всего, кодонзависимое связывание RF возможно только после транслокации пептидил-т РНК из А-участка в Р - участок. В экспериментах in vitro можно прямо связать триплет AUG и инициатор-ную F-Met - tRNA с Р - участком вакантной рибосомы, а затем добавить RF и триплет UAA ( или UAG, или UGA); последние связываются и индуцируют гидролиз F-Met - tRNA в Р - участке с освобождением свободного формилметионина. Довольно очевидно, что в указанном случае терминирующий триплет и RF попадают в вакантный А-участок. Тот факт, что супрессорная аминоацил-т РНК с EF-TU и ГТФ, несущая антикодон, комплементарный терминирующему кодону, конкурирует с RF в процессе трансляции, тоже говорит об А-участке как месте связывания RF. Такие ингибиторы А-участка рибосомы, как тетрациклин и стрептомицин, ингибируют кодонзависимое связывание факторов терминации с рибосомой. EF-G, стабильно связанный с рибосомой ( например, в присутствии фусидовой кислоты), мешает как связыванию комплекса Aa - tRNA EF-TU GTP, так и RF с рибосомой. Белок прокариотической рибосомы L7 / L12, образующий боковой стержень на 50S субчастице, способствует как связыванию факторов элонгации, так и RF. Данные по ингибированию кодонзависимого связывания RF антителами к индивидуальным рибосомным белкам подтверждают, что место связывания RF сильно перекрывается одновременно с А-участком и участком связывания факторов элонгации. [53]
В это же время инициирующая формилметионин-т РНК связывается с IF-2 и ГТФ. Это связывание происходит с помощью фактора IF-1, который способствует соединению мРНК с инициирующим комплексом, состоящим из малой субъединицы, формилметионин-т РНК, IF-2, IF-3, ГТФ. Белковый фактор IF-2 способствует соединению большой и малой субъединиц рибосомы. После присоединения большой субъединицы высвобождаются все инициирующие факторы, ГДФ и неорганический фосфат, т.е. процесс идет с затратой энергии. Смысл всех этих операций заключается в том, что мРНК соединяется с инициирующей ( формил) метионин-т РНК в рибосоме единственно возможным способом, определяющим точное положение рамкИ считывания ко-донов мРНК на инициирующем кодоне. В работающей рибосоме есть два участка связывания транспортных РНК ( тРНК): А-участок ( аминоацильный), имеющий сродство к аминоацил-т РНК, и Р - уча-сток ( пептидильный), имеющий сродство к пептидил-т РНК. [54]
Вопрос об энергетике транслокации долгое время был еильно запутан ввиду ряда исторических причин и из-за традиционности мышления биохимиков. Дело в том, что участие ГТФ в процессе транслокации стало известно раньше всех прочих фактов, касающихся этой стадии элонгационного цикла. Это создало мощный психологический стимул для выдумывания особых энергетических проблем в процессе транслокации, которые должны бы были решаться за счет энергии расщепления ГТФ. Практически все предложенные с тех пор модели транслокации предполагают, что энергия именно EF-G - оцосредованного гидролиза ГТФ так или иначе используется для механической работы по активному перемещению или хотя бы активному выталкиванию рибосомных лигандов ( тРНК) из их связывающих участков, а фактору EF-G и / или белку L7 / L12 часто приписывают функцию сократительных белков. Согласно одним моделям, энергия ГТФ через EF-G прилагается к пептидил-т РНК, занимающей А-участок, так что развиваемое усилие сдвигает ее вместе со своим кодоном по направлению к Р - участку, вытесняя деацилированную тРНК из Р - участка. В других моделях энергия ГТФ реализуется фактором EF-G первично для удаления ( выталкивания) деацилированной тРНК из Р - участка, и тогда пептидил-т РНК спонтанно переходит из А-участка в вакантный Р - участок, к которому она имеет большое сродство, увлекая с собой свой кодон матричного полинуклеотида. [55]
Аа - тРНК при поступлении в А-участок рибосомы связывается не соответствующим ей кодоном. Определенная вероятность такого захвата ( оцениваемая величинами порядка 10 - 3 - 10 - 4) обычно характерна для тРНК, несущих антикодон, частично комплементарный кодону. Результатом является замена правильного аминокислотного остатка на неправильный в соответствующем положении полипеп-тидной цепи. Вариантом этого рода ошибок является связывание, напр. Уровень ошибок зависит как от ряда внеш. В частности, известны мутации рибосомных белков, увеличивающие или уменьшающие, избирательность рибосомы при поступлении Аа - тРНК в А-участок и соотв. [56]
Вопрос об энергетике транслокации долгое время был еильно запутан ввиду ряда исторических причин и из-за традиционности мышления биохимиков. Дело в том, что участие ГТФ в процессе транслокации стало известно раньше всех прочих фактов, касающихся этой стадии элонгационного цикла. Это создало мощный психологический стимул для выдумывания особых энергетических проблем в процессе транслокации, которые должны бы были решаться за счет энергии расщепления ГТФ. Практически все предложенные с тех пор модели транслокации предполагают, что энергия именно EF-G - оцосредованного гидролиза ГТФ так или иначе используется для механической работы по активному перемещению или хотя бы активному выталкиванию рибосомных лигандов ( тРНК) из их связывающих участков, а фактору EF-G и / или белку L7 / L12 часто приписывают функцию сократительных белков. Согласно одним моделям, энергия ГТФ через EF-G прилагается к пептидил-т РНК, занимающей А-участок, так что развиваемое усилие сдвигает ее вместе со своим кодоном по направлению к Р - участку, вытесняя деацилированную тРНК из Р - участка. В других моделях энергия ГТФ реализуется фактором EF-G первично для удаления ( выталкивания) деацилированной тРНК из Р - участка, и тогда пептидил-т РНК спонтанно переходит из А-участка в вакантный Р - участок, к которому она имеет большое сродство, увлекая с собой свой кодон матричного полинуклеотида. [57]