Cтраница 3
Так как из простых термодинамических соображений следует, что К К а Ка К; К ЬК КЬК ( см. схему 10.19), и из условия задачи К а Ка и К ь С А г, то легко получить для нашего случая К К и / Ci / Ci. Это означает, что как протонирование, так и депротони-рование активной формы фермента ЕН приводит к ухудшению константы ингибирования фермента, поэтому зависимость эффективной константы ингибирования от рН имеет вид перевернутого колокола. [31]
Рассмотрим все три уравнения вместе и проанализируем, что между ними общего. Сразу бросается в глаза, что все они содержат два новых члена: [ / ] - молярную концентрацию ингибитора и Ki - константу ингибирования. Иногда предпочитают другие алгебраические преобразования, однако форма, приведенная в уравнениях (6.55) - (6.57), обладает тем преимуществом, что она легко запоминается. [32]
Из этого уравнения следует, что величина / 5о при постоянной концентрации субстрата однозначно определяет величину константы ингибирования. Заметим, что для частного случая весьма малых концентраций субстрата, когда AT [ S ] 1, значение / 50 численно равно величине, обратной константе ингибирования. [33]
Если не принять это во внимание, то, исполь -, зуя метод экстраполяции линейных участков кривых до пересечения с осями координат, можно получить неверные значения Кт и V. Вообще следует сказать, что экстраполяция линейных участков кривых, выражающих субстратное ингибирование, не может служить методом оценки Km и V, если при этом не учитывать значений констант ингибирования. [34]
Другим преимуществом является большая быстрота и расход очень небольших количеств фермента. Использование аффинной хроматографии для определения, например, констант ингибирования ферментов, по-видимому, весьма перспективно. Данные об объемах элюатов, содержащих фермент, на колонке с иммобилизованным ингибитором, полученные при использовании различных концентраций ингибитора в растворе, позволяют определить константы ингибирования как для связанного ингибитора, так и для ингибитора в растворе. Метод детально рассмотрен в гл. Большое преимущество этого метода состоит в том, что при использовании одного и того же ингибитора как для иммобилизации, так и для элюирования можно непосредственно сделать выводы о влиянии связей с носителем и природы носителя на изучаемое взаимодействие на основании совпадения или различий в определяемых величинах констант диссоциации. Следовательно, метод аффинной хроматографии открывает новые возможности не только для изучения взаимодействия биологически активных веществ, он перспективен также и для выяснения влияния микроокружения на образование этих комплексов. [35]
Данные, изложенные в этих работах, свидетельствуют по существу о том, что в составе целюлазного комплекса, кроме целлобиазы, присутствует фермент, продуктом действия которого является глюкоза. Однако в последнее время, с развитием методов выделения и очистки ферментов, когда были получены гомогенные эндоглюканаза и целлобиогидролаза, продуктами действия которых может быть глюкоза, надежность выводов о присутствии экзоглюкозидаз в большинстве целлюлазных комплексов в значительной мере поколебалась. Глю-конолактон являлся сильным конкурентным ингибитором экзоглюкозидазы ( константа ингибирования была порядка 1 - 10 мкМ), глюкоза ингибировала фермент по неконкурентному механизму. [36]