Метод - остановленная струя
Cтраница 3
Из этого следует, что график зависимости l / fterr от 1 / [ S ] должен дать константу скорости k и константу Михаэлиса - Ментен Кгл, однако он не может дать значения индивидуальных констант k - i и ki, которые входят в / См. Задача может быть решена методом остановленной струи, при использовании которого скорость образования комплекса фермент - субстрат может быть найдена измерением его концентрации после смешивания фермента и субстрата. [31]
Из этого следует, что график зависимости l / fterr от 1 / [ S ] должен дать константу скорости k н константу Михаэлиса - Ментен / ( м, однако он не может дать значения индивидуальных констант k - i и kz, которые входят в / См. Задача может быть решена методом остановленной струи, при использовании которого скорость образования комплекса фермент - субстрат может быть найдена измерением его концентрации после смешивания фермента в субстрата. [32]
Интересные результаты, полученные при определении числа фосфатсвязывающих центров, привлекли в последнее время значительное внимание. Экспериментальное подтверждение этого было получено методом остановленной струи [66, 68, 72], при помощи которого - было обнаружено, что величина предстационар-ного выброса продукта равна примерно 1 молю на моль фермента. Нейман [35] обнаружил связывание 1 моля ингибитора. [33]
Метод остановленной струи требует быстрой регистрации; это единственное существенное ограничение его применимости. Имея детектор с достаточно малой постоянной времени, метод остановленной струи можно использовать для исследования реакций с временами полупревращения от нескольких миллисекунд до секунд или даже минут. Таким образом, он является более гибким, чем метод непрерывной струи, хотя его минимальное время полупревращения немного больше. Для этого метода требуется значительно меньше жидкости ( 0 1 - 0 2 мл), что является большим преимуществом в тех случаях, когда исходные вещества или растворители трудно приготовить или очистить. Аппаратура дает фотографическую регистрацию каждого опыта: повторение осуществляется быстро и легко. Точность при определении констант скоростей этим методом примерно та же, что и при обычных кинетических измерениях ( стандартное отклонение 1 - 2 %, ср. Сложность конструирования примерно такая же, как для более простых форм аппаратуры метода непрерывной струи ( стр. [34]
Вместо проведения последовательных измерений в анализируемом и холостом растворах использовали метод остановленной струи, поскольку при низких концентрациях первый способ имеет ограничения, обусловленные остаточным нефарадеевским током. Ячейка изготавливается из плексигласа. В полости ячейки, содержащей около 2 мл раствора, находятся два электрода: ТПЭ и электрод сравнения Ag / AgCL Растворы, протекающие через ячейку под действием собственного веса, поступают через стеклянный капилляр внутренним диаметром 2 мм. Измерения проводят таким образом: сначала измеряют ток, генерируемый на электроде, на котором поддерживают соответствующий потенциал ( - 0 1 В) при скорости потока раствора около 3 мл / мин, а затем измеряют остаточный фарадеевский ток при остановленном потоке. Разность двух величин тока является мерой концентрации электроактивного вещества. В интервале концентраций феррицианида 0 - 1 мкМ получена почти линейная калибровочная кривая. Хотя данный способ и не был впоследствии использован для автоматического анализа, нет видимых причин, препятствующих его применению. [35]
Кинетика этого процесса [ уравнения ( 31) - ( 33) ] была изучена с помощью спектрофотомет-рических методов остановленной струи. Видимый спектр промежуточного комплекса обладает характерным для анионных с-комплексов двойным максимумом ( разд. [36]
Величины рк а групп, ответственных за стадии ацилирования и деацилирова-ния, согласуются с этими результатами. Кроме того, эти данные свидетельствуют о том, что самая быстрая реакция, которая может быть прослежена методом остановленной струи, включает О-ацилирование серина. Это, конечно, не исключает возможности N-ацилнрования, за которым следует очень быстрый N - Ю ацильный перенос, как было постулировано для ферментативной реакции с ДФФ. Эрлангер, Кастлемен и Купер [43] изучили отщепление протона, происходящее при реакции дифенилкарб-амилхлорида с а-химотрипсином. [37]
Перспективы использования ВЭЖХ в данной области рассматриваются в работе [42], которая продемонстрировала одну из представляющих интерес особенностей ВЭЖХ: спектры элюата можно получать методом остановленной струи. [38]
В настоящее время метод остановленной струи широко применяется для решения многих задач химической кинетики: установление механизмов химической реакции, определение стадий, лимитирующих протекание реакции; обнаружение промежуточных комплексов, определение кинетики ферментативных реакций, установление числа и концентрации активных центров фермента, изучение быстрых конформационных переходов в белках и нуклеиновых кислотах. Метод требует быстрой регистрации; это единственное существенное ограничение его применимости. Особое внимание при применении метода остановленной струи необходимо уделять тер-мостатированию, так как разница в температурах в кювете наблюдения и растворе смеси реагентов может привести к большим оптическим ошибкам, затрудняющим установление механизма наблюдаемой реакции. Точность определения констант скоростей данным методом примерно такая, как и при обычных спектрофото-метрических измерениях кинетики химических реакций. [39]
 |
Титрование гидроксидом натрия тетрапептида аланилглицилглицилгли. [40] |
Пептидные комплексы Cu ( II) и Ni ( II) исследованы особенно большим числом экспериментальных методов, так как они в одно и то же время термодинамически относительно устойчивы и кинетически лабильны. В системах Cu ( II) - пептид и Ni ( II) - пептид равновесия устанавливаются достаточно быстро [ особенно в случае Cu ( II) ], что позволяет для определения их термодинамических параметров успешно применять метод потенциометрического титрования и калориметрический метод. Кинетика реакции была исследована методом остановленной струи и релаксационным методом. [41]
Радикалы, вышедшие пз клетки, могут вступать в различные радикальные и радикально-цепные реакции в среде, способной к химическому превращению. Этот опыт является модельным для установления механизма процесса инициирования радикально-цепных реакций. Различные релаксационные методы ( импульсный фотолиз, метод остановленной струи и др.) позволяют определить константы скоростей элементарных стадий окисления. [43]
Реакция происходит в то время, когда полностью смешанные растворы проходят через выводную трубку, и наблюдение состава в различных местах трубки ( например, спектроскопически) эквивалентно наблюдению реакционной смеси в различное время после смешивания. Этим методом могут изучаться реакции, которые заканчиваются за несколько миллисекунд, но основным недостатком этого метода является то, что необходимы очень большие объемы растворов. Метод был улучшен, и его модификация - метод остановленной струи ( разд. [44]
Реакция происходит в то время, когда полностью смешанные растворы проходят через выводную трубку, и наблюдение состава в различных местах трубки ( например, спектроскопически) эквивалентно наблюдению реакционной смеси п различное время после смешивания. Этим методом могут изучаться реакции, которые заканчиваются за несколько миллисекунд, но основным недостатком этого метода является то, что необходимы очень большие объемы растворов. Метод был улучшен, и его модификация - метод остановленной струи ( разд. [45]
Страницы: 1 2 3 4