Ауксотрофный мутант
Cтраница 1
Ауксотрофные мутанты не могут образовывать ингибиторы соответствующего метаболического пути, работающие по принципу отрицательной обратной связи, так как у них отсутствует определенная ключевая ферментативная реакция. Поэтому при выращивании мутантного штамма в среде с минимальной концентрацией необходимого питательного ингредиента они способны образовывать избыточные количества вещества-предшественника или близких к нему метаболитов блокированной реакции. Так, первые реакции в цепи биосинтеза L-аргинина ( рис. 4.5) у Corynebacterium glutamicum ингибируются по механизму обратной связи самим конечным продуктом, и образование соответствующих ферментов подавляется L-аргинином. [1]
Ауксотрофные мутанты Pseudomonas aeruginosa, полученные при действии НГ, дефицитны по метионину ( И), гистидину ( 5), аргинину ( 4), триптофану ( 4) и другим метаболитам. Исследуемые штаммы отличаются по способности ауксотрофов к реверсии. [2]
Получить ауксотрофные мутанты, способные накапливать конечные продукты неразветвленных цепей биосинтеза, например L-аргинин, невозможно. В таких случаях приходится отбирать мутанты с частично нарушенной регуляцией биосинтеза, что позволяет получить повышенный выход конечного продукта. Такие мутанты известны под названием регуляторных; их отбирают по устойчивости к аналогам аминокислот или же средин ревертантов ауксотрофов. В основе использования аналогов-аминокислот лежит их сходство с природными аминокислотами. Они ингибируют рост бактерий, но этот эффект может быть уменьшен путем добавления соответствующей природной аминокислоты. Таким образом, аналоги выступают в роли искусственных, работающих по принципу обратной связи, ингибиторов-ферментов, обеспечивающих биосинтез природных аминокислот. Появление мутантов, устойчивых к этим ложным ингибиторам, означает, что регуляторные ферменты соответствующего пут № обмена становятся у них нечувствительными к аналогу. Так, серусодержащий аналог лизина 5 - ( 2-аминоэтил) - Ь - цистеин является у Brevibacterium flauum ложным, действующим по принципу обратной связи ингибитором аспартокиназы. Устойчивые к его действию мутанты вырабатывают фермент, который в 150 раз менее чувствителен к ингибированию по механизму обратной связи, чем фермент исходного штамма, и в результате продуцируют до 33 г / л лизина. [3]
 |
Йенициллиновый метод, применяемый для накопления и выделения ауксотрофных мутантов Escherichia coli или других бактерий, чувствительных. [4] |
Методы накопления ауксотрофных мутантов основаны на одном общем принципе: для клеточной суспензии создают такие условия, при которых подлежащие выделению мутанты не растут, а растущие прото-трофные клетки отсеиваются или уничтожаются. Существуют средства, которые действуют только на растущие клетки, а нерастущим, покоящимся, не причиняют вреда. После удаления антимикробного агента и добавления необходимых факторов роста начинают расти ауксотрофные клетки. [5]
При выделении ауксотрофных мутантов отмечено восстановление способности роста на MG колоний, не выросших при от-печатывании. Это явление, по-видимому, связано с сильным соматическим эффектом НММ. Частота возникновения ауксотрофных мутаций оказалась довольно высокой, что свидетельствует о гаплоидности спор V. Аналогичные выводы были сделаны исследователями, получавшими ауксо-трофные мутанты у V. Установлено, что частота возникновения ауксотрофных мутаций у V. Как видно из приведенных данных ( см. таблицу), использование для получения ауксотрофных мутаций НММ намного более эффективно, чем использование ультрафиолета. Всего выделено 127 ауксотрофных мутантов с потребностью в различных аминокислотах, основаниях, витаминах. [6]
Анализ большого числа ауксотрофных мутантов, различающихся по потребностям в индивидуальных факторах роста, позволяет не только изучать метаболизм, но и судить о генотипе данного организма. Допустим, что мы выделили мутант ( назовем его z), для роста которого на минимальной среде необходим один-единственный фактор роста - соединение Z. В большинстве случаев удается найти второй мутант, у, для роста которого на минимальной среде необходимо или соединение Z, или соединение Y. Иногда можно выделить третий мутант, х, который также является ауксо-трофом по веществу Z, но способен расти не только в присутствии Z, но также в присутствии X или Y. Пусть, далее, мы получили мутант w - четвертый ауксотроф по Z, который может расти в присутствии любого из четырех соединений - W, X, Y или Z. Допустим, что вещество W - хорошо известный промежуточный продукт обмена. [7]
В результате изучения ауксотрофных мутантов выяснено, что продуценты орнитина являются аргинин - или цитруллиндефи-цитными; продуценты гомосерина или диаминопимелиновой кислоты - треониндефицитными; продуценты изолеицина - лизин-дефицитными; продуценты тирозина - фенилаланиндефицитны-ми. [8]
Продуценты лизина являются ауксотрофными мутантами с нарушенным биосинтезом ряда аминокислот. Поэтому для обеспечения нормального развития микроорганизмов требуется введение в состав среды биотина и гомосерина. Гомосерин, по данным многих авторов, может быть заменен суммой двух аминокислот - треонином и метионином. Но концентрация треонина в составе среды должна быть точно регламентирована. [9]
 |
Слияние растительных протопластов и возможная сегрегация хлоропластов. 1 и 2 - протопласты разной видовой принадлежности, 3 - гетерокарион, 4 - гибриды, Г и 2 - цибриды. [10] |
В этом смысле удобны ауксотрофные мутанты. [11]
Для повышения селективности можно выбрать ауксотрофные мутанты, которые сами не приспособлены для синтеза соответствующей аминокислоты и используют аминокислоту, получаемую в побочном синтезе прежде всего при синтезе пептида. Сначала этот метод ограничивался в основном только ферментами бактерий, так как только бактерии могут выращиваться в больших объемах. Для того чтобы распространить этот метод на высокоорганизованные системы, можно было бы в принципе отклониться от метода, использующего культуры соответствующих клеток, поскольку этот метод сопряжен с большими затратами, и соответственно практическая ценность его невелика. [12]
Для повышения селективности можно выбрать ауксотрофные мутанты, которые сами не приспособлены для синтеза соответствующей аминокислоты и используют аминокислоту, получаемую в побочном синтезе прежде всего при синтезе пептида. Сначала этот метод ограничивался в основном только ферментами бактерий, так как только бактерии могут выращиваться в больших объемах. Для того чтобы распространить этот метод на высокоорганизованные системы, можно было бы в принципе отклониться от метода, использующего культуры соответствующих клеток, поскольку этот метод сопряжен с большими затратами, и соответственно практическая ценность его невелика. [13]
На этом примере видно, что ауксотрофные мутанты могут оказаться исключительно полезными для выяснения неизвестных путей метаболизма. [14]
 |
Методы отбора и идентификации разных типов мутантов. [15] |
Страницы: 1 2 3