Cтраница 3
Образование гибридов грибов с помощью слияния протопластов изучалось очень активно; этот метод нашел применение в промышленности при создании штаммов Cephalosporium acremo-nium, для которых характерны высокая скорость роста и большой выход цефалоспорина. Первые опыты по слиянию были выполнены с ауксотрофными мутантами Geotrichum candidum, у которых не обнаружено ни половой, ни парасексуальной систем. [31]
Для производства аминокислот бактерии стали использоваться с начала 50 - х годов. Штаммы их постоянно улучшали генетическими методами, выделяя ауксотрофные мутанты и мутанты с измененными регуляторными свойствами. Чтобы обеспечить образование аминокислот в больших количествах, в любом случае необходимо изменить систему регуляции обмена. [32]
Основное направление шикиматного пути завершается в этой точке; от хоризмата ( 9) расходятся по меньшей мере пять биосинтетических путей к основным метаболитам: трем а-аминокислотам ( L-фенилаланину, L-ти-розину, L-триптофану), п-аминобензойной кислоте ( 14), кофер-ментам ряда фолиевой кислоты и изопреноидным хинонам. Важные биохимические и химические особенности каждой стадии общего пути биосинтеза хоризмата из углеводных предшественников были выяснены в результате комплексного исследования, включавшего применение метода меченых атомов, изучение метаболизма ауксотрофных мутантов и подбор соответствующих ферментов. [33]
Таким образом, фенотип гибрида был уже известен, и его можно было принять за стандарт при отборе. В этой новой области селекции растений предстоит еще большая работа, и успех ее определяется тем, сможем ли мы использовать обширный набор маркеров ( например, устойчивости к химическим веществам в: токсинам) или ауксотрофных мутантов растений. [34]
При посеве культур уколом в мягкий МПА мутанты отличаются между собой характером пигментирования. Ауксотрофные мутанты штамма А-197 преимущественно беспигментные ( 13) или с желто-зеленым ( 24), зеленым ( 11) и слабо желтым ( 6) пигментированием. Ауксотрофные мутанты штамма В-586 все пиг-ментообразующие: с желто-зеленым ( 9), зеленым ( 2), желтым ( 7) и, в отличие от штамма А-197, с серо-синим ( 4) и темно-синим ( 2) пигментированием. [35]
Таким образом, найдя колонию рекомбинантов на чашке Петри, мы узнаем, из какой колонии исходных клеток F происходят клетки, приведшие к рекомбинантам. Аналогичным образом, выбирая другой ауксотрофный мутант в качестве женской культуры, мы отбираем из той же популяции F 1 другие мутанты Hfr с началом хромосомы вблизи локусов Lac, Тгур, Вь М и др. Тем самым основные положения гипотезы Воль-мана и Жакоба оказываются доказанными. [36]
Засеваем испытуемой культурой ряд чашек Петри с максимальной средой и агаром. Получаем сотни и тысячи колоний, небольшая доля которых - ауксотрофные мутанты. Далее делаем отпечатки каждой чашки с выросшими колониями на свежих чашках с агаром и минимальной средой. Для этого удобен технический прием, предложенный Ледербергом: привести в соприкосновение поверхность стерильного кусочка бархата с поверхностью чашек Петри с выросшими колониями, затем коснуться бархатом поверхности агара в чашках с минимальной средой. После инкубации мы убеждаемся, что некоторые колонии на минимальной среде не растут. Это и есть искомые мутанты. Их не очень много и на них-то и сосредоточивается внимание. Платиновой петлей мы переносим их на различные промежуточные среды. Для этого нужно залить ряд чашек Петри агаром с минимальной средой плюс тем или иным метаболитом. На каждой чашке Петри наносятся в определенном систематическом порядке все найденные ауксотрофные мутанты, которым мы присваиваем определенные индексы. [37]
После воздействия, индуцирующего мутации, и многочасового роста бактериальную суспензию инкубируют в среде с глюкозой, но без азота. Это делается для того, чтобы дать возможность клеткам использовать оставшиеся растворимые соединения азота. Прототрофные родительские клетки растут, и пенициллин их убивает, тогда как ауксотрофные мутанты, нуждающиеся в определенной аминокислоте, не растут, и это позволяет им уцелеть. Затем суспензию освобождают от пенициллина промыванием или добавлением пенициллиназы и высевают на агаризованную среду, содержащую аминокислоты. [38]
Удалим теперь фильтрованием из культуральной среды клетки мутанта I и поместим в нее клетки мутанта II, тоже нуждающегося в аргинине, но уже по другой причине-из-за неспособности синтезировать промежуточный продукт D. Культураль-ная среда от мутанта I будет, очевидно, поддерживать рост мутанта II, потому что в ней присутствует предшественник D, Однако отфильтрованная культураль-ная среда мутанта II не должна поддерживать рост мутанта I. Именно этим путем удалось в конечном счете идентифицировать все четыре предшественника аргинина - А, В, С и D. В подобных экспериментах по перекрестному питанию с использованием ауксотрофных мутантов Neurospora crassa или Escherichia coli были выяснены пути биосинтеза многих аминокислот. [39]
Мутантов, у которых изменена чувствительность какого-нибудь аллостерического фермента к эффектору, можно также выделять с помощью совершенно иного принципа, а именно как ревертантов к ауксотрофии. При этом поступают следующим образом. Сначала выделяют мутантов с дефектом регуляции, ауксотрофных в отношении метаболита, который хотят получить как конечный продукт, накапливающийся в среде. Затем среди этих ауксотрофных мутантов отбирают таких, у которых неспособность к синтезу данного метаболита обусловлена дефектом в аллостериче-ском ферменте соответствующего пути биосинтеза. После этого из полученной мутантной популяции выделяют прототрофных ревертантов, которые не нуждаются в этом конечном продукте, так как сами спо-собнц его синтезировать. Среди ревертантов отбирают тех, которые выделяют нужный продукт в среду. Их можно выявить биоавтографическим методом ( разд. [40]
Мутации - это изменения в генном аппарате клетки, которые сопровождаются изменениями контролируемых этими генами признаков. Различают макро - и микроповреждения ДНК, ведущие к изменению свойств клетки. Мутации бывают прямые и обратные, или реверсивные. Обратные мутации представляют собой возвращение, или реверсию, к дикому типу. Способность к реверсии характерна для точечных мутаций. В результате мутаций изменяются такие важнейшие признаки, как способность самостоятельно синтезировать аминокислоты и витамины ( ауксотрофные мутанты), способность к образованию ферментов. Эти мутации называют биохимическими. По происхождению мутации разделяют на спонтанные и индуцированные. Спонтанные возникают самопроизвольно без вмешательства человека и носят случайный характер. Индуцированные возникают при воздействии на микроорганизмы физических или химических мутагенных факторов. К физическим факторам, обладающим мутагенным действием, относятся ультрафиолетовое и ионизирующие излучения, а также температура. Химическими мутагенами являются ряд соединений и среди них наиболее активны так называемые супермутагены. В природных условиях и эксперименте изменения в составе бактериальных популяций могут возникать в результате действия двух факторов - мутаций и автоселекции, происходящей в результате адаптации некоторых мутантов к условиям среды обитания. Такой процесс, очевидно, наблюдается в среде, где преобладающим источником питания является синтетическое вещество, например, ПАВ или капролактам. [41]
При выделении ауксотрофных мутантов отмечено восстановление способности роста на MG колоний, не выросших при от-печатывании. Это явление, по-видимому, связано с сильным соматическим эффектом НММ. Частота возникновения ауксотрофных мутаций оказалась довольно высокой, что свидетельствует о гаплоидности спор V. Аналогичные выводы были сделаны исследователями, получавшими ауксо-трофные мутанты у V. Установлено, что частота возникновения ауксотрофных мутаций у V. Как видно из приведенных данных ( см. таблицу), использование для получения ауксотрофных мутаций НММ намного более эффективно, чем использование ультрафиолета. Всего выделено 127 ауксотрофных мутантов с потребностью в различных аминокислотах, основаниях, витаминах. [42]
Засеваем испытуемой культурой ряд чашек Петри с максимальной средой и агаром. Получаем сотни и тысячи колоний, небольшая доля которых - ауксотрофные мутанты. Далее делаем отпечатки каждой чашки с выросшими колониями на свежих чашках с агаром и минимальной средой. Для этого удобен технический прием, предложенный Ледербергом: привести в соприкосновение поверхность стерильного кусочка бархата с поверхностью чашек Петри с выросшими колониями, затем коснуться бархатом поверхности агара в чашках с минимальной средой. После инкубации мы убеждаемся, что некоторые колонии на минимальной среде не растут. Это и есть искомые мутанты. Их не очень много и на них-то и сосредоточивается внимание. Платиновой петлей мы переносим их на различные промежуточные среды. Для этого нужно залить ряд чашек Петри агаром с минимальной средой плюс тем или иным метаболитом. На каждой чашке Петри наносятся в определенном систематическом порядке все найденные ауксотрофные мутанты, которым мы присваиваем определенные индексы. [43]