Cтраница 4
Недавно было описано [42, 43] использование этилполифосфата ( полученного растворением пятихлористого фосфора в этиловом эфире) для полимеризации мононуклеотидов. Нуклеотиды ( 2 -, З - или 5 -фосфаты, а также 2 3 -циклофосфаты) смешивают непосредственно с вязким эфиром полифосфорной кислоты и оставляют при температуре около 50 - 60; добавляемый пиридин катализирует полимеризацию. После диализа продуктов реакции были выделены с выходом 10 - 20 % недиализуемые полинуклеотиды. Молекулярные веса, определенные седиментационным и вискозиметрическим методами, колеблются от 2 101 до 5 104, что указывает на наличие в цепи приблизительно 100 нуклеотидов. Этот же метод применим и для полимеризации дезоксинуклеотидов. [46]
Ангидрид, однако, не должен быть слишком активным, так как при обработке циклофосфата, например, тетра-л-нитрофенилпиро-фосфатом полимеризации не происходит, что, возможно, объясняется быстрой атакой нуклеозидциклофосфатом промежуточного Р: - нук-леозид-2 3 -цикло - Р2 - ди - / г-нитрофенилпирофосфата, в результате которой образуется Р1, Р2 - ди ( нуклеозид-2 3 -цикло) пирофосфат. Такие соединения обычно очень трудно полимеризуются, но легко гидролизуются до нуклеозид-2, 3 -циклофосфата. Аналогично реакциям анионного обмена, описанным выше ( стр. [47]
В подходящих условиях фермент обнаруживает синтетическую активность. Помимо полимеризации нуклеозид-2 3 -циклофосфатов, рибонуклеаза может катализировать образование З - алкиловых эфиров при соответствующей обработке уридин-2 3 -циклофосфата рибонуклеазой и первичными спиртами. [48]
Этот полимер вполне устойчив к действию щелочи и к ферментативному гидролизу обычными диэстеразами и, скорее всего, содержит фосфоамидные межнуклео-тидные связи между 2 ( или 3) - фосфатными группами и 6-амино-группой соседнего цитозина. Следует отметить, что при ацетилировании сначала образуется промежуточный смешанный ангидрид уксусной кислоты и цикло-фосфата ( в результате взаимодействия цитидин-2 3 -циклофосфата с уксусным ангидридом), который и является ацилирующим агентом. По существу, различие между двумя типами соединений объясняется неравенством значений констант диссоциации ( рК) гид-роксильных групп фосфатного остатка ( около 1 и 6 5 соответственно), принимающих участие в образовании ангидридной связи. [49]
Если нуклеотид содержит незащищенную ис-гидроксильную группу, примыкающую к фосфатному остатку, то нельзя применять дициклогексилкарбодиимидный метод, так как в этом случае легко образуются циклические фосфаты, которые, будучи диэфирами фосфорной кислоты, уже не могут превращаться в метафосфаты. Трудностей при использовании и удалении защитных групп в ряду рибонуклеотидов можно избежать, если превратить нуклеозид-2 ( 3) - фосфат в 2 3 -циклофосфат, в котором свободна лишь одна 5 -гидроксильная группа. [50]
Устойчивость этого соединения при рН7 зависит от характера 2 -гидроксильной группы, находящейся в г ис-положении к нуклеотидопептидной связи. Удаление ацетильной группы вызывает одновременный распад соединения XVIII, приводящий в основном к ди нуклеозидфосфату ( около 80 %), уридин-2: 3 -циклофосфату и 2: З - изопропилиденуридину ( последние образуются в соотношении 1: 1), а также фенилаланину. Можно предположить, что механизм расщепления диуридинфосфофенилаланина XVIII, а следовательно, и более сложных структур типа III, в которых пептид связан фосфоамидной связью с межнуклеотидным фосфором, подобен механизму щелочного расщепления уридилил - ( 3 - М) - фенилаланина XIII, с той лишь разницей, что в результате нуклеофильной атаки межнуклео-тидного фосфора 2 -гидроксильной группой может произойти разрыв как по связи Р - N ( путь 1), так и по связи Р - О ( путь 2) ( см. схему на стр. [51]
При щелочном гидролизе РНК образуется смесь нуклеозид-2 - фосфатов X и нуклеозид - З - фосфатов XI, что согласуется как со структурой V ( R OH) для РНК, так и с изомерной ей структурой, содержащей 2 - 5 -фосфодиэфирные связи, и с любой структурой, в которой 2 - 5 - и 3 - б - фосфодиэфирные связи чередуются в произвольном порядке. Исследование механизма щелочного гидролиза РНК показало185, что этот результат объясняется участием гидроксильной группы при С-2 остатка рибозы в процессе расщепления фосфодиэфирнои связи и промежуточным образованием ну-клеозид-2 / 3 -циклофосфатов XII, которые расщепляются далее с образованием смеси X и XI ( более подробно - см. гл. [52]